[发明专利]一种体外耳蜗微器官功能单元及其三维构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种体外耳蜗微器官功能单元及其三维构建方法和应用。本发明利用分离的单个小鼠耳蜗前体细胞三维诱导培养为耳蜗类器官，通过三维共培养耳蜗类器官与螺旋神经元组织，同时诱导耳蜗类器官分化成熟为毛细胞和促进螺旋神经元生长，构建了具备毛细胞和螺旋神经元之间突触连接的耳蜗微器官功能单元。该耳蜗微器官功能单元为听觉功能重建提供新思路和良好的应用模型，用来研究再生的毛细胞与螺旋神经元形成功能性的突触的调控机制，更好的研究内耳发育机制、毛细胞和螺旋神经节神经元损伤机制和干预措施、毛细胞再生调控与听功能重建等一系列的难题。

技术领域

本发明属于干/前体细胞三维培养领域，具体涉及一种体外耳蜗微器官功能单元的三维构建方法。

背景技术

根据世界卫生组织2019年的统计数据，目前全球约有4.66亿听力障碍患者，占全部人口的5%以上，而这一数字仍在以每年几十万甚至上百万的速度增长着。在我国，耳聋是仅次于肢体残疾的第二大致残疾病，在影响患者生活质量的同时也给家庭和社会带来了沉重的负担。目前的研究表明，耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元不可逆性的损伤和缺失是导致感音神经性耳聋的主要原因，因此探索内耳损伤机制和干预措施有望为感音神经性耳聋建立新的生物学治疗方法。

但是，哺乳动物耳蜗结构位于侧颅底深部骨性结构内，难以接近，在体研究困难重重；组织和细胞高度特化，生物学样本获取困难。因此建立可靠的体外研究模型对于感音神经性耳聋发病机制和干预措施的研究极为重要。

2003年李华伟教授了首次从成年鼠前庭感觉上皮中分离出了内耳干细胞（Li,H., Liu, H. Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse innerear. Nat Med9, 1293-1299.），为体外构建内耳微器官奠定了基础。但是传统悬浮培养将内耳前体细胞培养在悬浮培养皿中，缺乏细胞外基质的作用，导致内耳前体细胞生存期短、增殖能力差、分化结构单一不规则的缺点（Xia, M., Chen, Y., He, Y., Li, H. Li,W. Activation of the RhoA-YAP-beta-catenin signaling axis promotes theexpansion of inner ear progenitor cells in 3D culture. Stem Cells.）。近年来随着三维培养技术的进步，多种组织，如肝、胰腺、小肠和胃等的前体/干细胞被陆续培养为相应的类器官。利用胚胎/诱导多能干细胞所培育的耳蜗类器官，经鉴定其所含毛细胞为前庭感觉器属性（Koehler, K. R. et al. Generation of inner ear organoids containingfunctional hair cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol35,583-589.）。尽管有研究通过分离新生鼠的耳蜗感觉上皮前体细胞通过三维培养的方式建立的内耳感觉上皮的类器官（McLean, W. J. et al. Clonal Expansion of Lgr5-Positive Cells from Mammalian Cochlea and High-Purity Generation of SensoryHair Cells. Cell Rep18, 1917-1929.），形成了具备相关耳蜗毛细胞标志物阳性的类似耳蜗感觉上皮的结构。