[发明专利]一种重组Exendin-4多肽的纯化方法

说明书

本发明提供一种重组Exendin‑4多肽的纯化方法，包括如下步骤：1)取重组Exendin‑4多肽粗纯进行亲和层析I，得到亲和层析液I；2)亲和层析I液进行超滤，得到超滤液；3)将超滤液进行酶解，得酶解液；4)将酶解液进行亲和层析II和阴离子交换层析I，得到阴离子交换层析液I；5)将阴离子交换层析液I进行反相层析，得到反相层析液；6)将反相层析液进行阴离子交换层析II，得到阴离子交换层析II液。融合蛋白酶解前增加超滤工艺，去除了破菌澄清液中未破碎的菌体残留等杂蛋白；该方法提高了目的蛋白纯度和回收率。

技术领域

本发明涉及产品纯化领域，具体涉及一种重组Exendin-4多肽的纯化方法。

背景技术

中国专利文献CN1635117A公开了一种制备重组Exendin-4多肽的新工艺，其中公开了重组Exendin-4多肽的纯化法，包括：亲和层析-酶解蛋白-亲和层析-反相层析-离子交换层析，然而上述纯化方法获得的重组Exendin-4多肽蛋白规模、纯度、得率均有待于进一步提高，从而进行商业化生产。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组Exendin-4多肽的纯化方法，该方法生产的重组Exendin-4多肽纯度和回收率均较高。

一种重组Exendin-4多肽的纯化方法，包括如下步骤：

1)取重组Exendin-4多肽粗纯进行亲和层析I，得到亲和层析液I；

2)亲和层析I液进行超滤，得到超滤液；

3)将超滤液进行酶解，得酶解液；

4)将酶解液进行亲和层析II和阴离子交换层析I，得到阴离子交换层析液I；

5)将阴离子交换层析液I进行反相层析，得到反相层析液；

6)将反相层析液进行阴离子交换层析II，得到阴离子交换层析II液。

可选的，步骤5)中洗脱采用梯度洗脱，先用体积百分数67％流动相A和体积百分数33％流动相B混合洗脱杂质，洗脱1个柱体积；再用体积百分数45％流动相A和体积百分数55％流动相B混合洗脱目的蛋白；A280吸收值为0.4AU时开始收集反相层析液，达到最大峰值后，A280吸收值降至0.4AU时停止反相层析液的收集；流动相A为含有10mmol/L PB和体积百分含量为10％乙醇的溶液，pH为7.5-8.5(可选的，pH为8.0)；流动相B为体积百分含量为80％乙醇水溶液。

可选的，超滤所用超滤膜的孔径为5KD-10KD。

可选的，亲和层析I所用的层析柱为镍离子螯合亲和层柱，上样量为2.60g-3.40g粗纯/mL填料，采用Buffer B进行洗脱，得亲和层析液I；所述Buffer B为含有PB和咪唑的溶液，pH为7.5-8.5(可选的pH为8.0)；PB的浓度为8mmol/L-12mmol/L(可选的10mmol/L)；咪唑的浓度为45mmol/L-55mmol/L(可选的50mmol/L)，洗脱峰收集范围A280吸收值为0.3～0.1AU。

可选的，还包括凝胶过滤层析的步骤；

Sephadex G-25Fine为凝胶过滤介质；

可选的，凝胶过滤层析以Buffer M为洗脱液，A280吸收值达到0.01AU开始收集，达到最大峰值，再降至0.01AU时终止收集；Buffer M为30mmol/L醋酸缓冲液，pH5.5；洗脱流速为30mL/min。

可选的，反相层析的层析柱为Source 15RPC；上样量为5mg/mL～8mg/mL填料；洗脱的速度为22mL/min-26mL/min；A280为0.5AU时开始收集反相层析液，达到最大峰值后，A280吸收值降至0.05AU时停止反相层析液的收集。