[发明专利]一种新的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

说明书

本发明公开了一种新的短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)等位基因阶梯的制备方法。该方法主要根据基因座上的STR信息设计并合成PCR扩增引物和质粒，以合成的质粒作为PCR扩增模板，把同一基因座的所有等位基因进行一管扩增，再根据差异情况进行分组扩增，最后进行纯化和适当稀释后获得制备好的短串联重复序列等位基因阶梯。本发明实现了用较少的PCR反应次数得到均衡性较好的等位基因阶梯的目的，可保证每个等位基因片段产物量的均衡而无需进行特别调整，节省了制备过程中的生产成本、人力成本和时间成本，大大提高了工作效率。

技术领域

本发明属于基因检测技术、基因工程领域，更具体地，涉及一种新的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法。

背景技术

短串联重复序列(Short Tandem Repeats,STR)是由2-6bp重复单位构成的核心序列，是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，主要由核心重复序列拷贝数的变化产生长度多态性，遵循孟德尔遗传规律，遗传稳定，是目前普遍应用的遗传标记，被广泛地应用在遗传学、法医学、临床医学、肿瘤学、基因诊断中的个体识别、亲权鉴定、肿瘤诊断等领域。

STR在法医学个体识别和亲权鉴定中，最常用的方法是先通过PCR扩增STR基因座，再通过毛细管电泳平台对不同大小的片段进行分离，最后样品峰与标准参照物比对确定等位基因，在这个过程中实现准确分型的标准参照物就是等位基因阶梯，由此可见，等位基因阶梯在STR最终分型结果判读中具有重要作用。

国内已有的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法一般有以下几种：

(1)从人的有核细胞中提取DNA，根据STR基因座设计并合成PCR扩增引物,用PCR方法扩增STR基因座，通过大量样本来筛选寻找各基因座的等位基因型，对各基因座的等位基因片段进行序列分析，测定各片段的碱基数和串联单位数，以获得不同等位基因型的DNA样本或扩增产物，对不同等位基因型的DNA样本进行混合，以混合的DNA样本作为扩增模板，采用相应的PCR引物进行PCR扩增，对扩增的产物进行纯化定量得到等位基因阶梯。

(2)从人有核细胞中提取DNA，用PCR方法扩增STR基因座以得到各基因座对应的等位基因型，对不同等位基因的PCR产物进行基因克隆以获得每一个等位基因对应的质粒，或者采用全基因合成得到各基因座所有等位基因对应的质粒。将具有不同等位基因的质粒进行等量混合，以混合质粒为扩增模板，采用相应的PCR引物进行PCR扩增，对扩增的产物进行纯化定量得到等位基因阶梯。

(3)或者以上述(2)的DNA样本或质粒为模板，采用相应的PCR引物对单个等位基因进行扩增，对PCR扩增产物进行纯化定量后混合各个等位基因得到STR基因座的等位基因阶梯。

(4)又或者将上述的扩增产物为模板进行稀释后再次进行PCR扩增，以第二次扩增的产物为STR基因座的等位基因阶梯。

上述制备方案的缺点主要体现在：

采用上述方案制备等位基因阶梯，从人有核细胞中提取DNA进行扩增，提取样本过程不仅繁琐、工作量大，还会出现部分等位基因难以收集齐全的情况，且还需要对大量样本进行筛选，这个过程费时费力，不适合大批量生产。而且为了生产能够延续下去，需要一直收集DNA样本，不同模板的质量差异会使不同批次的等位基因出现质量差异。采用样本DNA或质粒作为模板对单个等位基因进行扩增后对产物进行纯化定量混合，则需要对两、三百个片段进行几百次扩增，工作量过大，不同等位基因间的微小差异经过扩增后会出现显著差异，难以准确进行定量混合，而准确定量混合难度大且麻烦，造成不同等位基因间均衡性较差，同时对生产车间的环境要求高。而全部等位基因一起扩增虽然可以大大减少工作量，扩增过程中片段较短的可以得到较好的扩增，但是长片段的产物不容易等量扩增，使扩增产物的量差异较大，甚至有少数等位基因无扩增产物，造成最终制备的等位基因阶梯的各个等位基因均衡性差。