[发明专利]siRNA的制备方法

说明书

本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种siRNA的制备方法，该制备方法包括如下步骤：体外转录获得目的基因的dsRNA；用RNase Ⅲ对所述目的基因的dsRNA进行消化处理，得到消化产物；将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；将所述胶块研磨冻融后，获得siRNA。该制备方法具有准确有效、操作简便、成本低廉的特点，为纯化siRNA以及RNAi研究带来极大的方便，具有很好的应用前景。

技术领域

本申请属于核酸提取技术领域，尤其涉及一种siRNA的制备方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术可以通过双链RNA的介导，降解靶基因的mRNA，在转录后水平上特异性地阻断或降低靶基因的表达，达到类似基因敲除的效果，而操作比基因敲除简单，有着投入少、实验周期短等优势，是一种可以大量进行基因功能检测的高效且经济的研究方法，已经被广泛用于研究特定基因的功能。

在RNAi实验中，获得小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)是沉默靶基因的首要步骤。目前有多种方法制备siRNA，其中较为常用的有化学合成法、体外转录法、体内载体表达法、siRNA表达框架法、RNaseⅢ体外消化dsRNA(Double-stranded RNA，双链RNA)法等。

一个基因的不同siRNA对其可能会有显著不同的抑制效果，化学合成法、体外转录法、体内载体表达法、siRNA表达框架法等均需要寻找和验证最有效的siRNA，因而可能会消耗更多时间。而使用RNaseⅢ消化长dsRNA制备法无需验证和寻找有效地特定siRNA，可以很好地解决这个问题，为研究者节省不少经费及时间。该方法主要步骤为：先通过PCR制备DNA模板(在PCR引物地5’端加上T7启动子序列，以启动转录)，使用加上T7启动子序列的DNA模板体外转录制备dsRNA，然后使用大肠杆菌RNaseⅢ消化dsRNA，形成siRNA片段，去除未消化的dsRNA即可纯化得到siRNA混合物。该方法得到的产物含有多种不同序列的siRNA，不同siRNA可能存在序列的重叠，几乎可以覆盖整个靶区段，不必筛选有效片段即可保证可有效降解靶mRNA，适合快速经济地研究某一基因功能缺失的表型。然而RNaseⅢ消化长dsRNA除了产生12-30bp的短的dsRNA，也产生一些＞30bp的dsRNA。在哺乳动物细胞中，长度超过30bp的长dsRNA不仅无法触发细胞中的RNAi，而且会激活通常由IFN诱导的dsRNA依赖的激酶PKR和2'-5'-寡腺苷酸合成酶。激活的PKR通过磷酸化翻译因子真核起始因子2α来抑制翻译过程，而2'-5'-寡腺苷酸合成酶则通过激活RNase L引起非特异性mRNA降解，从而对细胞会产生毒性作用。因此，需要对RNaseⅢ消化后的产物进行纯化，以获得较纯的12-30bp的siRNA。

dsRNA的分子量＝碱基数(bp)x 680Da/bp，那么30bp dsRNA对应的分子量即为20.4kDa。因此，目前普遍采用30kDa的超滤管纯化RNaseⅢ消化后的dsRNA混合物。然而，超滤管价格昂贵，不适用于需要研究多个基因的大量制备siRNA；而且超滤管纯化在上样前需要将RNaseⅢ消化的混合物稀释，导致纯化的siRNA浓度较低，需要再次进行siRNA浓缩步骤，操作较繁琐。

因此，相关技术有待改进。

发明内容

本申请的目的在于提供一种siRNA的制备方法，旨在解决现有RNaseⅢ体外消化dsRNA制备siRNA成本高、步骤繁琐的技术问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

本申请提供一种siRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

体外转录获得目的基因的dsRNA；

用RNaseⅢ对所述目的基因的dsRNA进行消化处理，得到消化产物；