[发明专利]一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用

说明书

本发明公开了一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解胶体几丁质上的应用。将从土壤中筛选到的菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC‑H1进行基因组测序分析、克隆CmChi3、构建重组菌株、表达CmChi3蛋白、纯化HIS‑TAG、并鉴定重组蛋白具有两个催化结构域，两个几丁质结合域，具有内切酶和糖苷水解酶两种酶的性质，能高效水解几丁质并以GlcNAc为终产物。此研究预期为单酶法高效生产GlcNAc提供理论依据和基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种糖苷水解酶 CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用。

背景技术

几丁质（Chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键聚合而成的天然高分子多糖，是地球上含量仅次于纤维素的第二大糖类聚合物，其分子式为(C₈H₁₃O₅N)n，相对分子量在100万以上。几丁质在自然界中广泛存在于真菌细胞壁、昆虫甲壳及虾蟹壳中。几丁质主要来源于虾蟹壳，使用10%的氢氧化钠和浓盐酸对其进行脱蛋白和脱钙处理后可以得到较高纯度的几丁质。随着虾蟹养殖业的发展，产生的虾蟹壳等下脚料越来越多，而这些下脚料多作为固体废弃物被丢弃，堆放几天即会发生腐化并散发出难闻的恶臭，不仅浪费了资源，同时还大大加重了环境负担。因此，利用几丁质废弃物生产高附加值化学品不仅能解决环境问题，还能带来巨大的经济效益。

几丁质作为虾蟹壳中一个主要的组分，可用来生产多种高附加值的含氮化学品，如N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、几丁寡糖及其衍生物等。其中，GlcNAc属于功能性氨基单糖，具有重要的生理功能。目前有许多报道是关于GlcNAc生理活性的应用，比如，GlcNAc对关节炎、类风湿性关节炎、软骨挫伤、关节损伤和退行性关节病治疗也具有增强关节病的治疗效果；GlcNAc含有氨基带正电荷与酸性基团发生反应进而调节细胞周围的酸碱性，达到抑制癌细胞的增长的作用；GlcNAc作为透明质酸的组成成分，用于护肤品具有很好的保湿效果，通常的添加量为0.1-0.5%。另外还有报道GlcNAc在食品添加剂行业具有广泛的应用空间。

目前利用几丁质生产GlcNAc 的方法主要有化学法、物理法和生物酶法。化学转化法主要是通过浓盐酸分解几丁质得到氨基葡萄糖盐酸盐，之后进一步乙酰化合成GlcNAc。该方法成本较低，是目前工业化生产GlcNAc的主要手段，但其产物并不认为是天然的GlcNAc，不能作为食品添加剂使用，并且这种方法会产生大量的工业废水，对环境造成一定的污染。微生物发酵法是目前比较流行的一种方法，通过大肠杆菌的基因工程菌株进行生产GlcNAc。微生物发酵合成法虽然条件温和，但此法后期分离成本高、难度大，也会造成虾蟹壳大量的积累。生物酶法是通过酶催化反应，对几丁质进行酶解，过程绿色、能耗低及专一性强，是实现几丁质向GlcNAc转化的最佳途径，近年来已成为几丁质降解研究的热点。

文献“Production of N-Acetyl-d-glucosamine from Mycelial Waste by aCombination of Bacterial Chitinases and an Insect N-Acetyl-d-glucosaminidase[J]. Journal of Agricultural  Food Chemistry, 2016, 64(35):6738.” 中报道Zhu等利用三个细菌来源的重组几丁质酶 (SmChiA、SmChiB、SmChiC)和一个昆虫来源的重组N-乙酰氨基葡萄糖苷酶协同降解结晶型几丁质，24 h 后GlcNAc 与几丁二糖的比例达93:7。该方法从降解几丁质获取GlcNAc需要多种酶的共同作用，成本较高，转化时间长，无法应用于大规模的生产。