[发明专利]一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒，包括样本洗脱液、髓过氧化物酶检测试剂和牙龈蛋白酶检测试剂，样本洗脱液为三羟甲基氨基甲烷、3‑吗啉丙磺酸、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、哌嗪‑N,N'‑二(2‑乙磺酸)或2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸水溶液；髓过氧化物酶检测试剂包括氧化酶、氧化酶对应的底物和显色剂A，氧化酶和其对应的底物相遇后能够产生过氧化氢，显色剂A包括Trinder反应色原底物；牙龈蛋白酶检测试剂为牙龈蛋白酶检测试剂I或II，牙龈蛋白酶检测试剂I包括底物BAEE、乙醇氧化酶和显色剂B，显色剂B包括过氧化物酶和Trinder反应色原底物；牙龈蛋白酶检测试剂II包括BANA和重氮盐显色剂。

技术领域

本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒和检测方法。

背景技术

阿尔茨海默症(AD)是一种中枢神经退行性疾病，占老年性痴呆中的60-70％。临床主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。特征性病理改变为β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的细胞外老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结(NFT)，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。

AD的确切病因和病机仍未完全阐明，但都认同AD的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，感染是主要的环境因素，中枢神经系统的炎症反应在AD的发生和发展中起着关键作用。

已明确与AD相关的感染病原体包括病毒、细菌、螺旋体等，其中最重要且研究较透彻的是牙周致病菌，主要包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola，Td)、伴放线聚集杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，Aa)、中间普氏菌(Prevotella intermedia，Pi)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)等，这些菌都是革兰阴性厌氧菌，正常情况下可以菌斑生物膜的形式定植在牙菌斑处。当牙周局部免疫防御屏障破坏而感染时，牙周致病菌大量增殖，并释放牙龈蛋白酶等多种毒性产物，刺激局部中性粒细胞渗出，破坏牙龈和牙周组织，引起牙龈炎和牙周炎(合称牙周病)。病原菌及其毒性产物、中性粒细胞释放的胞外酶、炎症介质等可通过多种机制，引起中枢神经系统特征性病理改变。因此，牙周致病菌感染是AD发生的启动因子和病情恶化的促进因子。牙周致病菌感染的控制，对AD预防、AD病情发展控制措施的制订有重大指导意义。

通常临床通过神经精神症状特点、特征性病理标记物对AD进行诊断。例如通过对Aβ、Tau蛋白的检测来支持AD的诊断，通过对特定基因(如淀粉样蛋白前体蛋白基因(APP)、早老素1、2基因突变(PS1、PS2))的检测来判定家族性早发型AD的风险高低，通过对载脂蛋白APOE4基因的检测来作为散发性AD的确诊依据。

牙周致病菌的感染标志物包括病原菌标志物、炎症标志物两类。

病原菌标记物包括病原菌个体、基因、毒性产物三类。病原菌个体主要包括上述Pg、Td、Aa、Pi、Fn等牙周致病菌，常规通过培养法检测，但不能反映感染菌数量；致病菌特有基因可通过PCR检测，但也不能反映感染菌数量；致病菌的毒性产物包括脂多糖、蛋白酶、凝集素A等，其中的牙龈蛋白酶(gingipain)为牙周致病菌共有，可采用酶化学法、免疫学法检测，可定量，可直接反映感染菌数量。

炎症标记物包括中性粒细胞和炎症介质两种。中性粒细胞形态特殊，含特异酶(如弹性蛋白酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶、胶原酶(基质金属蛋白酶-8，MMP-8))，可通过形态学观察法、酶化学法、免疫学法等定量检测，标本中的中性粒细胞数量能直接反映局部炎症的严重程度。炎症介质包括细胞因子(如白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ))和前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)等，可用采用免疫学方法检测，可定量，能间接反映局部炎症程度。