[发明专利]可用于纯化人免疫球蛋白G的疏水性环状肽配基

说明书

本发明提供了可用于分离纯化人免疫球蛋白G的疏水性环状肽配基，所述疏水性环状肽配基通过计算机模拟仿生设计方法得到，该仿生设计方法以SpA与hIgG‑Fc片段上的C_H3结合区域上的氨基酸序列Ser383‑Asn389为模拟体系，通过LeDock分子对接和FlexX分子对接、Amber分子动力学模拟筛选确定可与hIgG有特异性结合作用的疏水性环状肽配基，采用所述环状肽配基色谱介质从人血清样品中对hIgG进行纯化研究，可获得高达96%的纯度和92%的回收率；所述疏水性环状肽配基序列为‑[HWG‑C‑AKTE]‑、‑[YF‑C‑WRHE]‑、‑[WV‑C‑LHHYF]‑、‑[PYF‑C‑TIE]‑、‑[FY‑C‑DEHL]‑，其中效果最好的肽配基为‑[HWG‑C‑AKTE]‑。

技术领域

本发明涉及人免疫球蛋白G的提纯技术领域，采用计算机模拟技术仿生设计人IgG的亲和肽配基库，然后利用亲和色谱试验验证肽分子对人IgG的纯化效果，属于生物仿生设计中的计算机模拟和下游蛋白分离纯化技术领域。

背景技术

当前抗体被广泛地应用于医学诊断和疾病治疗中，2006年FDA批准的20余种抗体类药物全球销售额超过170亿美元，其中 IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清Ig的75%，也是需求量最大的一类抗体。抗体药物制备通常采用沉淀、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱等方法完成，其过程成本约占生产成本的30％～40％。金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)、蛋白G和蛋白L作为亲和配基已广泛用于制备高纯度抗体，这类配基特异性高，然而过高的亲和力需要较苛刻的洗脱条件，容易导致目标蛋白变性和配基脱落，吸附容量较低，此外这类配基的制备也比较困难，价格昂贵，蛋白经固定化后一般会失去部分活性，以上使得蛋白类配基的应用受到限制。

多肽作为亲和配基具有较多优越性，但自然界中与目标蛋白有亲和力的多肽数量十分有限，如何选择合适的多肽序列作为亲和配基，以及如何提高多肽的亲和力和选择性的问题是影响多肽亲和色谱应用的关键。现有的筛选和设计方法主要分为实验筛选和理性设计，实验筛选是基于组合库技术进行高通量实验筛选，理性设计主要是基于目标蛋白或已有配基的结构和性质设计新配基。

天津大学孙彦教授课题组采用6个SpA关键残基：F132、Y133、H137、E143、R146和K154构建模拟体系，利用分子对接和分子动力学模拟进行多肽库的筛选，可获得人IgG纯度在88%以上、回收率在65%以上的线性八肽分子FYWHCLDE、FYTHCAKE等，虽然其纯化效果也较好，但是离商业化应用还有较长的路程，其是基于蛋白A与IgG之间的疏水作用模型进行模拟，但获得的多肽序列却是基于静电作用与hIgG进行结合，本领域公知静电作用不是特异性吸附作用，易吸附其它生物质分子，获得的蛋白纯度不高，很难商业化利用。

发明内容

本发明基于蛋白A与hIgG-Fc片段上的C_H3结合区域（hIgG-Fc- C_H3），选取结合区域中的氨基酸序列Ser383-Asn389（SNGQPEN）作为模拟对象，利用其三维结构信息，构建以Cys作为连接残基的环状肽库，接着采用半柔性分子对接程序LeDock和FlexX将多肽库中的多肽分子依次与hIgG-Fc片段进行分子对接（两次半柔性分子对接），根据打分分数选取结合自由能较高的多肽分子，然后利用Amber软件程序将初筛得到的多肽系列与Fc片段之间进行分子动力学模拟，排除不能与Fc片段稳定结合的多肽序列，以上属于本发明的计算机模拟设计部分，然后进行实验验证部分，即通过亲和色谱试验验证模拟得到的多肽序列与hIgG之间的实际结合情况以及纯化效果，确定能够实际与hIgG特异性结合的亲和环状肽配基。

本发明具体技术方案为提出了可用于纯化人免疫球蛋白G的疏水性环状肽配基，所述疏水性环状肽配基通过计算机模拟仿生设计方法得到，所述仿生设计方法包括如下步骤：