[发明专利]用于测定氨甲苯酸冻干制剂体内行为的方法

权利要求书

1.测定生物体的生物样品中的氨甲苯酸含量的方法，该方法包括如下步骤：

(i)提供测定用的高效液相色谱系统，包括：

液相色谱系统：Agilent 1200二元梯度泵和CTC自动进样器；

液相色谱分析柱为ProteCol™-P C18 HQ105柱；

流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液体积比20：80的混合液，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长为230nm；进样体积20μl；

磷酸盐缓冲液的配制：取磷酸氢二钠12.0g，庚烷磺酸钠0.8g，加水900ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml，摇匀，作为磷酸盐缓冲液；

(ii)提供空白生物样品和含药生物样品，所述生物样品采集自被施用药剂前以及施用药剂后的生物体；

(iii)制备测试用溶液，并对所述含药生物样品进行处理制成用于液相色谱测定的供试液，包括如下操作：

制备内标储备液：精密称取内标对照品适量，用配液溶剂溶解制成内标储备液，其浓度为1~50μg/mL；所述内标为对甲基苯甲酸；

制备对照品储备液：精密称取氨甲苯酸对照品适量，用配液溶剂溶解制成对照品储备液，其浓度为1~50μg/mL；

制备对照液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液和内标储备液各1.0mL，配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得对照液，其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1~20μg/mL；

制备质控液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入对照品储备液10~500μL、内标储备液50~500μL和配液溶剂适量，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，得到质控液，其中的氨甲苯酸和内标物浓度各自独立地为0.1~20μg/mL；

制备空白尿 液：精密量取空白尿液2.5mL于10mL量瓶中，加配液溶剂6mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得空白尿液；

制备供试液：精密量取待测的含药尿液2.5mL于10mL量瓶中，精密加入内标储备液1.0mL和配液溶剂5.0mL，混匀，补加配液溶剂至刻度，涡旋1min，置于离心管中，12000r/min离心5min，上清液用0.20μm滤膜滤过，即得含药并添加内标的供试液；

(iv)在高效液相色谱系统中测定所述测试用溶液和供试液，并据此测定结果计算生物样品中的氨甲苯酸含量，

其中，

所述生物体是人；

所述生物样品是尿液；

所述药剂包含氨甲苯酸和冻干赋形剂；

所述药剂是氨苯甲酸的冻干粉针剂；

所述冻干赋形剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇、甘氨酸、右旋糖酐；

所述氨甲苯酸与冻干赋形剂的重量比为100：50~500；

所述配液溶剂是包含0.2%甲酸和0.15%氯化镁的乙腈溶液。

2.根据权利要求1的方法，其中液相色谱分析柱为ProteCol™-P C18 HQ105柱，其规格为5μm，250×4.6mm I.D.。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(iv)中，测定所述测试用溶液时，还对方法的下述任一项或多项进行测定：专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性、色谱残留。

4.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的专属性中，氨甲苯酸与内标的分离度大于5。

5.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的线性中，所得标准曲线的相关系数r大于0.99。

6.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的灵敏度中，检测限小于0.05μg/mL，定量限小于0.1μg/mL。

7.根据权利要求1的方法，步骤(iv)中，测定方法的准确度中，相对回收率和绝对回收率各自独立地大于90%。