[发明专利]一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法

说明书

本发明涉及植物病毒接种领域，具体涉及一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种的方法，该方法采用针管注射的方式，在西葫芦植株培养至子叶完全展开时即可接种，较之现有的针管注射方法，接种时间大大提前，接种10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，上述方法易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小更接近田间发病情况，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。

技术领域

本发明涉及植物病毒接种领域，具体涉及一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法。

背景技术

西葫芦是世界性大宗蔬菜之一，也是我国主要瓜类蔬菜。每年西葫芦种植面积约在500万亩以上，其中山东、山西、云南、西北等地区为我国重要的西葫芦优质产区。西葫芦病毒病是一种普遍发生且危害性很大的病害。侵染西葫芦的病毒主要有以下3种：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)，其中黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是引发西葫芦病毒病的最重要病原之一。CMV侵染西葫芦后表现为渐进的发病过程。发病早期幼嫩的叶片基部黄化，然后黄化症状逐渐扩展到整个叶片；随后新生叶片表现出明显的花叶；随着植株发育，叶片出现严重皱缩，植株矮化，叶色表现为无光泽的深绿色。西葫芦感染CMV症状的严重程度取决于感染时的株龄，一般幼苗期感染CMV会造成秃顶、矮化并减产，严重时可造成绝收；而成株感染CMV后的症状相对较轻。

抗病性鉴定是抗病材料筛选和抗病品种选育的基础，其关键在于能够准确反映材料的抗性水平。机械摩擦接种是目前常用的病毒病接种方法，这种方法一般采用接种前，先在叶片上喷洒金刚砂完成，但是机械摩擦接种需要较多的感病材料，且金刚砂的用量不好控制，费时费力有一定技术难度。目前，西葫芦病毒病的鉴定，主要采用田间自然发病的方式。由于西葫芦病毒病是由多种病原引起的，对接种结果的影响比较复杂，无法明确起主要作用的病原的作用，且不利于重复性的鉴定，对接种结果的一致性和客观性造成影响，直接影响到接种结果的可靠性。现有技术中有出现过一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法，其在辣椒苗两片真叶期对子叶进行注射接种病毒，但是这种方法并不适用于西葫芦植株，两者的生长速度和形态具有较大的差异，且上述现有技术接种的时间较晚，难以满足抗病性鉴定的要求。

因此能否提供一种针对西葫芦植株的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，成为本领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，该方法采用针管注射的方式，在西葫芦植株培养至子叶完全展开时即可接种，较之现有的针管注射方法，接种时间大大提前，接种10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，上述方法易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小更接近田间发病情况，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。

本发明的具体技术方案如下：

一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，具体步骤如下：

(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在子叶展平期西葫芦幼苗上人工注射接种，接种后三周采收发病叶片；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆后离心，其上清液即为接种液；

上述采收的发病叶片表现为皱缩或花斑或两者兼具；

(2)西葫芦种子消毒后人工培养至子叶完全展开时即可接种；

(3)接种时，用2mL无菌注射器吸取2mL接种液，用针头在子叶背面扎出1个针孔，去掉针头将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后昼夜温度保持在15-18℃，3天后温度调整为昼23℃-25℃，幼苗正常生长管理即可。

其中，步骤(1)中所述的磷酸缓冲液优选为pH值为7的0.01mol/L的磷酸缓冲液；每克病叶加入2.5mL所述的磷酸缓冲液进行冰浴匀浆；