[发明专利]一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。本发明通过提取克劳氏芽孢杆菌基因组DNA，经PCR扩增得到野生型碱性蛋白酶基因序列，将扩增得到的野生型碱性蛋白酶基因通过易错PCR进行随机突变，通过高通量筛选后获得了若干个高活力碱性蛋白酶基因，再将这些高活力碱性蛋白酶基因进行DNA改组，通过筛选后获得八个更高活力的碱性蛋白酶突变体基因。将这八个突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。

技术背景：

蛋白酶是催化蛋白肽键裂解，可将蛋白分子、多肽降解为小的肽链、氨基酸的一类水解酶，根据蛋白酶作用时适宜pH值的不同，可分为中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的最适反应pH值一般大于9，较其它蛋白酶而言，碱性蛋白酶的酶活力、耐热、耐碱能力更强，并且具有酯酶特性。这些优势使得碱性蛋白酶在工业上的应用更为广泛，其在洗涤剂、食品加工、饲料、环境保护、皮革制造和丝绸制造等行业都有着十分重要的作用。在洗涤剂中加入碱性蛋白酶能保持被洗衣物的原有色彩，提高产品的去污效果，有效减少洗涤剂中表面活性剂和某些助剂的用量，还能增加节水、节能和环境保护的效益。在食品中主要用来水解植物蛋白质，植物蛋白水解后转化成分子量更小的肽和氨基酸，更利于消化吸收，产品营养价值更高，产品质量和安全性也相对更好。在制革工艺中以蛋白质和蛋白质类似物为主要成分的皮与毛，通常情况下处理较为困难，传统的方法是利用有毒的化学物质进行处理，这种方法不但危害人们自身安全，而且对环境也有着很大的污染，而蛋白酶可以代替这些化学物质来降解制革过程中非胶质组分和非纤维蛋白，同时也可以减少环境的污染。

微生物是蛋白酶的重要来源，相比于植物蛋白酶和动物蛋白酶，微生物由于其生长迅速、易于人工遗传改造，产生的蛋白酶类资源丰富微生物可以在相对较短的时间内大量培养，因此可以生产大量的满足生产需要的酶类。产碱性蛋白酶的微生物主要从盐碱湖、深海、沙地等碱性环境中分离得到，目前，芽孢杆菌、放线菌以及真菌均有报道可以产碱性蛋白酶，但在工业生产中主要是芽孢杆菌属。然而，由于菌株自身产酶能力有限，导致了发酵酶活水平不高，芽孢杆菌产碱性蛋白酶的产品成本较高，限制了其大规模的应用。因此，提高碱性蛋白酶活力对其在工业生产及应用具有重要的意义。

蛋白质工程是建立在基因工程基础上的新技术，主要依靠计算机软件等辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对蛋白编码基因的人工定向改造，对蛋白质进行修饰、改造和拼接以获得能满足人类需要的新型蛋白质的技术。酶的定向进化又称为酶的体外分子定向进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程新的发展方向，它不用事先了解蛋白质的结构、活性位点、催化机制等因素，而是模拟自然进化过程，人为地创造特殊的进化条件，从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的酶前体)出发，在体外或体内对基因进行随机突变或体外基因重组，构建人工突变酶库，进一步通过一定的筛选或选择方法，最终获得预先所期望的具有某些特性的进化酶。体外定向进化常用方法主要是易错PCR(Error-prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)。易错PCR是通过利用低保真度TaqDNA聚合酶和改变PCR反应条件，如加入Mn、改变循环次数和dNTP浓度等，降低DNA复制的保真度，在新DNA链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。DNA改组是将一个或一组密切相关的基因序列，在DNaseI作用下切割成一系列随机大小的DNA小片段，由于基因的同源性，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导，随机重组，最后通过特定引物的PCR，生成全长基因，在这一过程中，由于模板的变换产生了相关序列间的交换，从而产生了多样的基因重组文库，再进一步对改组的基因表达的产物进行筛选，从而达到目的基因的定向进化。