[发明专利]一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1)整合GFP的人腺病毒的制备；2)对人腺病毒滴度的检测，应用TCID₅₀法进行检测；3)阳性药物，Brincidofovir，Cidofovir对HEK-293细胞的MTT试验，使用MTT试剂盒，按照其说明书进行检测；4)药物抑制人腺病毒增殖的高通量筛选；所述的整合GFP的人腺病毒的制备步骤为利用pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒构建质粒pAd-YFP，将质粒pAd-YFP转染到293FT细胞获得整合GFP的人腺病毒；其中步骤4)的筛选方法包括24孔板筛选方法或48孔板筛选方法，其中24孔板筛选方法具体为：

第1d，24孔板，每孔铺HEK-293细胞5×10⁴，即用1mL培养基中含有5×10⁴cells/mL，吸取1mL到24孔板中；

第2d，铺板后24h，加药；试验应有(1)空白对照组，即：不加药，不加病毒组，(2)阳性病毒对照组，即：只加病毒，不加药组，(3)阳性药物组，即加病毒，加阳性药物，西多福韦Cidofovir 50μM和Brincidofovir 250nM，(4)试验组，即：加病毒，加需要筛选的药物；

加药后2h，加病毒，每孔加2μL人腺病毒，MOI＝0.1；空白对照组不加病毒；

第5d，加病毒后，第3d，铺细胞：24孔板，每孔1×10⁵的HEK-293细胞，即用1mL培养基中含有1×10⁵cells/mL，吸取1mL到24孔板中；和第一次铺的细胞孔数一致；

第6d，取第一次铺板每孔的病毒上清100μL，到第二次铺板的细胞中，顺序和第一次一致；

第8d，即加病毒后第2d，对第2次铺的细胞板，弃上清，100μL胰酶消化，加200μL培养基进行中和，反复吹打后，吸入流式管中进行流式分析，并记录每个样品的检测结果；

将待测药物的流式结果和阳性药物组进行比较，分析待测药物是否具有抑制人腺病毒的作用；

其中48孔板筛选方法具体为：

第1d，48孔板，每孔铺HEK-293细胞2.5×10⁴，即用1mL培养基中含有5×10⁴cells/mL，吸取500μL到48孔板中；

第2d，铺板后24h，加药；试验应有(1)空白对照组，即：不加药，不加病毒组，(2)阳性病毒对照组，即：只加病毒，不加药组，(3)阳性药物组，即：加病毒，加阳性药物，西多福韦Cidofovir 50μM和Brincidofovir 250nM，(4)试验组，即：加病毒，加需要筛选的药物；

加药后2h，加病毒，每孔加2μL腺病毒，MOI＝0.1；空白对照组不加病毒；

第5d，加病毒后，第3d，铺细胞：48孔板，每孔5×10⁴的HEK-293细胞，即用1mL培养基中含有1×10⁵cells/mL，吸取500μL到48孔板中；和第一次铺的细胞孔数一致；

第6d,取第一次铺板每孔的病毒上清50μL，到第二次铺板的细胞中，顺序和第一次一致；

第8d，即加病毒后第2d，对第2次铺的细胞板，弃上清，100μL胰酶消化，加200μL培养基进行中和，

反复吹打后，吸入流式管中进行流式分析，并记录每个样品的检测结果；

将待测药物的流式结果和阳性药物组进行比较，分析待测药物是否具有抑制人腺病毒的作用。