[发明专利]一种高通量同时测定混培微生物粗酶中多种酶活性的方法

权利要求书

1.一种高通量同时测定混培微生物粗酶中多种酶活性的方法，其特征在于，多种酶水解底物所得的产物均为还原糖，测定方法包括如下步骤：

（1）在96孔板上规定每一行酶标条测定酶的种类，其中一行酶标条用于测葡萄糖标准曲线；

（2）布底物：在每一行酶标条的各个孔中添加待测酶对应的底物，用于测葡萄糖标准曲线的一行酶标条添加不同浓度的葡萄糖标准溶液；

（3）添加样品：在96孔板上第1列各个孔中添加蒸馏水做空白对照，在第2-12列各个孔中依次添加混培微生物粗酶样品S1-S11，其中，添加葡萄糖标准溶液的一行酶标条不添加任何物质；

（4）酶促反应：将96孔板置于38-40℃水浴锅中水浴30min；

（5）终止反应：沸水浴10-15min；

（6）显色反应：在96孔板的所有孔中各加入DNS试剂，沸水浴显色15min，反应结束后，利用彩虹酶标仪测量各个孔中溶液在540nm处的吸光度值；

（7）计算：利用葡萄糖标准溶液测得的吸光度值绘制葡萄糖标准曲线，根据葡萄糖标准曲线和测得的各个孔溶液的吸光度值，计算出相应的还原糖含量；

利用BCA法测定各混培微生物粗酶样品中的总蛋白含量，然后根据还原糖含量和总蛋白含量计算各种酶的活力；

所述多种酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、壳聚糖酶、果胶酶和几丁质酶；

步骤（2）中添加的底物分别为可溶淀粉溶液一、可溶淀粉溶液二、羧甲基纤维素钠溶液、木聚糖溶液、胶体壳聚糖溶液、果胶溶液和胶体几丁质溶液；

步骤（7）中利用BCA法测定各混培微生物粗酶样品中的总蛋白含量方法如下：

取两个新的酶标条，第1个孔中加入10uL蒸馏水，第2个孔中加入10uL浓度为563ug/mL的标准蛋白溶液，第3-24个孔中依次加入10uL混培微生物粗酶样品S1-S11，且相邻的两个孔添加同样的样品，计算时取平均值；然后在酶标条各孔中各加入100uL体积比为50:1的BCA/CuSO₄混合液，37℃孵育30min，然后利用酶标仪测量562nm处吸光度值；最后根据如下公式计算出各样品中总蛋白含量：

其中，为测得的第3-24个孔内各样品的吸光度值，为测得的第1个孔内空白溶液的吸光度值，为测得的第2个孔内标准溶液的吸光度值，N为样品测试前稀释倍数，V为样品体积10uL；

步骤（7）中计算酶活力的公式如下：

。

2.根据权利要求1所述的一种高通量同时测定混培微生物粗酶中多种酶活性的方法，其特征在于，布底物时，添加可溶淀粉溶液一的酶标条单独取出，于70℃保温15min后，再放回96孔板，然后添加样品。