[发明专利]一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用

说明书

本发明提供一种催化性能提升的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，所述突变体是来源自巨大芽孢杆菌CICC 10055的野生型谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突变为甲硫氨酸M得到。通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体Y280M在不同pH或温度条件下都表现出明显提高的酶活性，提示其更适合工业化生产γ‑氨基丁酸。

技术领域

本发明公开了一种活性增强的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyricacid, GABA)是一种重要的抑制性神经递质，具有降低血压、抗焦虑和抑郁、改善睡眠、提高记忆力、治疗癫痫等生理功能，在食品、医药和饲料等领域具有广泛的市场前景。γ-氨基丁酸因较好的生理功能和应用前景受到广泛关注，并被应用于食品、医药和化妆品中。日本厚生省、欧洲食品安全局和美国食品药品管理局承认乳酸菌发酵生产的GABA为天然食品添加剂。我国卫生部也批准此类产品为新资源食品。此外，γ-氨基丁酸还可用于合成2-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮可用于合成尼龙-4，具有重要的工业应用价值。据粗略统计，目前全球各类 GABA 总产能约6万吨/年，约10 %属于微生物法或植物富集法生产的可以应用于食品或医药等领域。

目前，γ-氨基丁酸生产包括化学合成法、植物富集法和微生物合成法等。化学合成的GABA有原料残留，因此安全性差，不能添加到食品中；植物中GABA含量低，富集提取成本较高；而微生物合成GABA因安全性高、生产成本低和对环境友好更具开发价值。谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15）能不可逆地催化L-谷氨酸（盐）转化生成γ-氨基丁酸，是生物转化法合成γ-氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的市场应用价值。但是，目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，这一特性已经严重影响了其在工业上的应用前景。

因此，通过筛选或分子改造谷氨酸脱羧酶，获得具有优良的催化性能的关键酶制剂，并基于此构建高效生物催化系统，是实现γ-氨基丁酸高产需要解决的主要技术问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化性能提升的谷氨酸脱羧酶突变体及其重组菌株，并使用该菌株建立了高效生产γ-氨基丁酸的全细胞转化方法。

本发明首先提供了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，是将对应于来源自巨大芽孢杆菌CICC 10055的野生型谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突变为甲硫氨酸M的氨基酸序列。所述谷氨酸脱羧酶突变体包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

其次，本发明提供表达了一种生产γ-氨基丁酸的双酶共表达载体，所述共表达载体是在一个质粒中同时导入谷氨酸脱羧酶突变体和γ-氨基丁酸转运蛋白的编码基因。进一步地，本发明提供一种重组菌株，其是将所述双酶共表达载体转化或导入宿主菌株所得。宿主菌株选自棒杆菌属、肠杆菌属或短杆菌属菌株，优选地是谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、黄色短杆菌、钝齿棒杆菌枯草芽孢杆菌等。

在一个实施方案中，所述双酶共表达载体中γ-氨基丁酸转运蛋白含有如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，其编码核酸序列如SEQ ID NO:6所示。根据本发明，用于所述突变体表达的载体种类没有特殊限定，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，用于所述突变体表达的宿主菌株也没有特殊限定，可以为本领域技术人员已知的各种模式菌株。

最后，本发明提供了一种高效制备γ-氨基丁酸的方法。采用发酵罐进行重组菌株的高密度发酵和蛋白诱导表达，制备全细胞催化菌泥；在纯水相体系中加入L-谷氨酸（盐）底物和全细胞催化菌泥，常温常压下进行γ-氨基丁酸制备。