[发明专利]一种低电位的电化学发光核酸检测方法

权利要求书

1.一种低电位的电化学发光核酸检测方法，包括步骤如下：

（1）传感器电极的制备

i、CIS@ZnS NCs的制备步骤如下：

(a)将谷胱甘肽（GSH）、柠檬酸钠（TSC）、氯化铜、氯化铟和硫化钠溶解于水中得混合液，升温至90-100℃反应30-60分钟，得CuInS₂核层溶液；所述谷胱甘肽和柠檬酸钠摩尔比为1:6-10；氯化铜、氯化铟和硫化钠的摩尔比为5：20：31；谷胱甘肽和氯化铜的摩尔比为1-3:1；

(b)将醋酸锌、硫脲和谷胱甘肽溶于水中得混合液，调节pH至6.0得ZnS壳层溶液；

(c)将ZnS壳层溶液和CuInS₂核层溶液混合均匀，90-100℃反应40-60分钟；然后经离心、洗涤即得CIS@ZnS NCs；

ii、以金电极作为工作电极，将捕获DNA标记在金电极表面制得Au/c-DNA；所述Au/c-DNA的制备步骤如下：

（a）将金电极置于食人鱼溶液中浸泡5-15分钟，经水清洗、干燥后用粒径0.5 μm的氧化铝粉末抛光，然后经超纯水清洗、电化学清洗、无菌水清洗、干燥即得经清洗处理的金电极；

（b）将捕获DNA（c-DNA）水溶液和三(2-羧乙基)膦（TCEP）水溶液混合均匀，37℃下孵育60-90分钟，得c-DNA/TCEP溶液；将c-DNA/TCEP溶液滴在经清洗处理的金电极表面，37℃下孵育8~10小时以使c-DNA一端的巯基和金电极之间形成稳定的Au-S键，经无菌水清洗以除去未反应的c-DNA，即得Au/c-DNA；

iii、CIS@ZnS NCs标记探针DNA，得到p-DNA/CIS@ZnS；所述p-DNA/CIS@ZnS的制备步骤如下：

将CIS@ZnS NCs 水溶液、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）以及羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合分散均匀后室温活化0.5-1小时，然后离心得到经活化的CIS@ZnSNCs；将所得经活化的CIS@ZnS NCs复溶于无菌水中，加入探针DNA（p-DNA），得混合液；所得混合液在37℃下孵育2-4小时，使探针DNA一端的氨基和CIS@ZnS NCs表面的羧基通过酰胺化反应连接，经离心分离即得p-DNA/CIS@ZnS；

iv、基于碱基互补配对原理，目标DNA被Au/c-DNA中的捕获DNA捕获固定，然后p-DNA/CIS@ZnS与目标DNA特异性结合，即制备得到传感器电极；

（2）ECL核酸检测

以步骤（1）制备的传感器电极作为工作电极、铂丝为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，以含15-25 mmol/L的水合肼（N₂H₄·H₂O）、0.05-0.2 mol/L硝酸钾的PBS缓冲溶液为电解液，进行电化学发光测试。

2.根据权利要求1所述低电位的电化学发光核酸检测方法，其特征在于，步骤（1）i中，包括以下条件中的一项或多项：

A、步骤（a）中，所述谷胱甘肽和柠檬酸钠摩尔比为1:8；谷胱甘肽和氯化铜的摩尔比为2:1；

B、步骤（a）混合液中，谷胱甘肽浓度为0.5-1.5mmol/L；

C、步骤（a）中，反应温度为95℃，反应时间为45分钟；

D、步骤（b）混合液中，所述醋酸锌、硫脲和谷胱甘肽的摩尔比为1:1:1-2；所述醋酸锌的浓度为35-45 mmol/L；

E、步骤（b）中，用NaOH水溶液调节pH；

F、步骤（a）、（b）中的谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽；

G、步骤（c）中，ZnS壳层溶液中的醋酸锌和CuInS₂核层溶液中的氯化铜的摩尔比为5-15:1；

H、步骤（c）中，所述反应温度为95℃，反应时间为50分钟。