[发明专利]一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用。本发明提供一种用于百合miRNA检测的内参基因，其具有如SEQ ID NO.1‑4任一所示的核苷酸序列。本发明提供的内参基因miRn46和miR399a在百合不同生长发育阶段、组织部位、非生物胁迫和生物胁迫条件下均能够稳定表达，适于作为不同实验条件下的百合miRNA相对水平检测的内参基因。与传统的内参基因相比，miRn46和miR399a作为内参基因具有更高的稳定性，能够显著提高百合miRNA相对水平检测的准确性。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于百合miRNA检测的内参基因及其应用。

背景技术

百合是一种兼具食用、药用及观赏价值的重要的球根花卉，具有十分重要的经济价值。为了改良百合植株性状，需要利用现代分子生物学手段对其重要的生理过程，包括开花，抗病和无性繁殖的调控机制等进行研究，这其中必然会涉及对百合基因表达丰度的检测。

随着植物生物遗传研究的精细化，关于miRNA在百合各种生理过程中的功能研究也越来越多。miRNA(microRNA)是一类长度约为21nt的内源非编码RNA，已被证实在植物生理过程中发挥着重要的调控作用。

qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)是研究基因表达模式，比较基因表达丰度的最常用的生物手段之一，具有灵敏度高、易操作、特异性好、信息丰富的特点。而在众多影响该实验结果准确度的因素中，用来标准化实验结果的内参基因的选择是保证实验结果准确的前提和关键。作为内部控制，理想的内参基因应在实验条件下保证较高的、稳定的表达量，即易于检测且表达恒定。但在不同条件下中，表达绝对稳定不变的内参基因是不存在的。同时由于miRNA的qRT-PCR扩增产物较短且部分miRNA在不同条件下表达量差异较大，较mRNA的qRT-PCR，miRNA检测难度更大。因此，在miRNA的qRT-PCR实验中，选择稳定的内参基因，对结果的准确度保证更为重要。

目前，在植物中，使用较多的传统的内参基因包括snRNA U6、rRNA 5S、5.8S、18S和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等，这些基因广泛参与基本的细胞过程，并在所有细胞中比较均匀地表达。但这些传统内参基因在一些实验条件下，表达量并不恒定不变(Thellin O,Zorzi W,Lakaye B,Borman BD,Coumans B,Hennen G,Grisar T,Igout A,Heinen E.Housekeeping genes as internal standards:use and limits.JBiotechnol.1999；75(2):291-295；Jain MK,Nijhawan A,Tyagi AK,KhuranaJP.Validation of housekeeping genes as internal control for studying geneexpression in rice by quantitative real-time PCR.Biochem Bioph Res Co.2006；345(2):646-651.)。此外，百合基因组巨大，生理调控过程复杂，但目前尚未见在百合中系统评价适用于miRNA qRT-PCR的候选内参基因在不同实验条件下稳定性的报道。因此，在以miRNA为检测对象的qRT-PCR检测之前，为保证检测结果的准确性，筛选出适合于尽可能多的实验条件，特别是涉及不同生长发育的样本的内参基因，是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于百合miRNA检测的内参基因，本发明还提供该内参基因的应用。