[发明专利]一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：

1）硫酸软骨素裂解酶产生菌制备

取新鲜鸭小肠，用破壁机粉碎，按重量份1:5-6添加无菌水制备鸭小肠溶液，搅拌10-20min，用160-180目筛子过滤，然后取滤液涂布培养基，进行平板培养分离，接着挑取单菌落，用斜面划线方法纯化；配制含有鱿鱼软骨粉末的培养基，将纯化后的单菌落点种于培养基平板，30℃-37℃恒温培养1-3天，向平板中倒入无菌水，浸泡3-5min；挑取产生透明圈的菌株，利用斜面划线培养,控制温度保持在30℃-37℃，120-150r/min振荡好氧培养1-3天；培养完成后，接种于液体培养基中进行生产菌的培养，在温度30-37℃、120-150r/min振荡通气培养1-3天，菌体密度为1×108 - 5×108个/ml时，即得硫酸软骨素裂解酶产生菌种子菌液；

2）鱿鱼软骨发酵

a.取鱿鱼软骨，用清水冲洗除杂，晾干后用粉碎机粉碎，加入无水乙醇浸泡2-5h，离心取沉淀，用无水乙醇清洗几遍，晾干备用；

b.步骤a中备用的鱿鱼软骨按重量百分数20%-30%和水混合，按6%-8%V/V量接种步骤1）中的种子菌液，温度30℃-37℃、pH7-10、120-150r/min振荡好氧恒温培养0.5-2天；

c.发酵完成后，离心除去沉淀，收集上清液并真空浓缩至固形物重量百分含量为30-35%；

3）纯化

a.步骤2）中获得的发酵浓缩液加入无水乙醇65-80%V/V，并调节pH5.2-7.0，搅拌30-60min，静置4-5h，离心去除上清液；

b.离心沉淀用去离子水溶解，溶液转入透析袋进行透析纯化，同时外加0.5-0.8V的直流电场，收集截留液，截留液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到74-81%V/V，同时调节pH5.5-6.5，静置8-10h，离心，重复结晶2-3次；

4）干燥

将步骤3）中得到的结晶冷风冻干，即得硫酸软骨素糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基、营养琼脂培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的鸭小肠取自用虾蟹壳作饲料成分饲喂2-3年的鸭子。

4.根据权利要求1所述的一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤2）b中，在接种前还加入了CaCl₂2-4%W/V、乙醇3-5%V/V。

5.根据权利要求4所述的一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤2）b中，在接种前还加入了CaCl₂3.5%W/V、乙醇4%V/V。

6.根据权利要求1所述的一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤2）b中，所述的发酵的同时还辅助超声波作用，超声波处理条件为：超声频率9-13KHz，超声功率0.55-1.3W/cm2，超声波施加时长2-4min/h/次。

7.根据权利要求1所述的一种鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤3）b中，所述的透析袋规格为80-150kD，且为即用型。