[发明专利]一种神经束膜细胞的体外培养及纯化方法

说明书

本发明涉及生物医学领域，具体是一种神经束膜细胞的体外培养和纯化方法，步骤如下：（a）取SD大鼠坐骨神经，分离获得神经束膜，将其贴块培养得到混合生长的神经束膜细胞、成纤维细胞和施万细胞；（b）首先运用限时消化法去除施万细胞，然后用差速贴壁法初步去除成纤维细胞；（c）重复上述操作1次；（d）运用化学药物阿糖胞苷进一步去除成纤维细胞。本发明建立了一种快速高效的体外纯化培养神经束膜细胞的方法，为深入研究周围神经损伤修复的机制提供稳定的细胞来源。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是一种神经束膜细胞的体外培养及纯化方法。

背景技术

周围神经损伤修复的研究比较广泛，但目前对于长距离周围神经缺损的治疗亟需攻克。周围神经由若干神经纤维束组成，神经表面有神经外膜包裹，而在神经纤维束的表面包有神经束膜；在神经纤维束内的每条神经纤维表面有神经内膜包绕；神经外膜、神经束膜和神经内膜内均有成纤维细胞分布，施万细胞形成髓鞘包绕轴突。神经束膜参与组成血-神经屏障[Morris AD, Lewis GM, Kucenas S. Perineurial Glial Plasticity and theRole of TGF-β in the Development of the Blood-Nerve Barrier. J Neurosci,2017, 37(18):4790-4807.]，分为外层和内层，外层为结缔组织，内层为7-8层神经束膜细胞通过紧密连接构成，对进入神经纤维束的大分子物质起屏障作用。可见，周围神经内除了神经元的轴突外，还包含有成纤维细胞、神经束膜细胞和施万细胞等多种细胞。近年来对于神经束膜细胞的研究显示，其除了形成血-神经屏障，还对周围神经损伤的修复有重要作用，如在受损区域形成神经束膜桥、吞噬细胞碎片、与施万细胞相互作用等[Kucenas S.Perineurial glia. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2015, 7(6):a020511.]。在周围神经受损后，神经束膜细胞率先向受损处迁移并吞噬细胞碎片，早于施万细胞的启动，形成细胞桥以桥接神经缺损处；而施万细胞的迁移和轴突的再生则在此之后发生[Schröder J,May R, Weis J. Perineurial cells are the first to traverse gaps of peripheralnerves in silicone tubes. Clin Neurol Neurosurg, 1993, 95[Suppl]:S78-S83.Lewis GM, Kucenas S. Perineurial glia are essential for motor axon regrowthfollowing nerve injury. J Neurosci, 2014, 34(38):12762-12777.]。因此，神经束膜细胞有希望成为多细胞动员治疗长距离神经缺损的关键细胞，值得深入研究。

体外培养纯度高活性强的神经束膜细胞对于研究周围神经损伤修复的相关机制十分关键。目前关于神经束膜细胞的体外培养国内尚未见报道，国外少有报道，且国外的报道仅采用反复贴块的方法[Peltonen J, Jaakkola S, Virtanen I,Pelliniemi L.Perineurial cells in culture. An immunocytochemical and electron microscopicstudy. Lab Invest, 1987, 57(5):480-488.]，该方法采用含10%血清的Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's Modified Eagle Media, DMEM）培养神经段，经过1～10次反复贴块，90%以上的组织块迁出的细胞为混和细胞，其中包括神经束膜细胞、成纤维细胞及施万细胞；仅有1%~5%的组织块迁出较纯的神经束膜细胞。该方法耗时久且细胞纯度不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种神经束膜细胞的体外培养及纯化方法，能快速高效地在体外纯化培养神经束膜细胞，同时保证神经束膜细胞生长状态良好，为深入研究周围神经损伤修复的机制提供稳定的细胞来源。