[发明专利]一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法

说明书

本发明提出了一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，先用改进的蔗糖梯度离心法制备较纯的孢子悬浮液，借助血球计数板计算孢悬液浓度，基于一定浓度的孢悬液的基础上，利用琼脂分块平面毛细管印迹法获取单休眠孢子，继而接种到ECD系统中易感品种ECD‑05催芽2～3d的健壮根毛上。与前人相关研究方法相比，主要克服了显微镜下单孢微小不易定位，液滴法视野分层过多且易干燥而无法吸取及显微操作无法精确挑取单孢等问题。平面毛细管印迹法结合可大大缩小显微镜镜检时需检查的视野范围，且分块的琼脂易于抓取，此外不需要先进的自动化仪器设备，可操作性强，可以显著提高单孢分离的效率。

技术领域

本发明属于微生物单孢分离技术领域，尤其涉及一种无法在人工培养基培养的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单休眠孢子的分离技术。

背景技术

十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin) 侵染引起的一种世界性土传病害，是十字花科植物的重要根部病害。芸薹根肿菌(P.brassicae)是一种专性活体寄生菌，1995年Ainsworth正式将根肿菌归入原生生物界根肿菌属。研究表明，根肿菌由于生理小种差异存在致病性分化，自然存在的群体常高度混杂。Mananares等发现现有的寄主鉴别法确定的生理小种内还能够细分出致病型，提出只有采用单孢菌系进行的检测结果才更接近小种的真实致病能力(Manzanares-Dauleux etal.,2001)。因此，在进行抗病性遗传分析的过程中，采用单孢分离、寄主扩繁、建立根肿菌单孢系鉴定根肿菌生理小种(single spore isolates,SSI)的方法所获得的鉴定结果更具有参考价值。

病原微生物的单孢分离和接种办法，归纳起来主要有以下四种：一是自动体系，其运用于根肿菌的单孢分离在一定条件下的成功率可以达到40％～50％；但其运用受实验室的条件制约；二是直接的毛细管法，但比较适合能在人工培养基生长并且长出菌丝的微生物；三是玻璃针法，制作要求的环境条件高，且应用受制于孢子大小的要求(要在解剖镜下可见)，操作也较为繁琐；四是方便快捷的涂布平板法，却不适用于强寄生性的根肿菌的分离。另外，针对根肿菌的单孢分离也有报道，主要有毛细管打孔法，印痕法以及稀释液滴法，这些方法单独来看都具有一定的理论支持，但大都费时费力，可操作性不佳，分离难度大。如毛细管打孔法，需要稳定的显微操作，且带单孢的水琼脂一面难以取出沾染根毛，印痕法一个单孢的获取需要多次转移及检查，稀释液滴法在镜检时液滴分层多需要不断调整焦距细致查找，且放大倍数大的情况下需要调整玻片位置反复检查多个视野。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于建立一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，在无特殊设备要求的情况下，能实现简单，方便，稳定，高效的分离微小的无法在人工培养基生长的单休眠孢子。

本发明的技术方案的实现如下述：

(A)根瘤洗净，腐熟后，表面消毒，榨成匀浆，经过过滤和密度梯度离心，得到浓缩的纯净孢悬液。

(B)配制2％g/ml水琼脂溶液，并于灭菌的罐头瓶中煮沸至完全透明无气泡。移液枪吸取1ml至载玻片(提前置于烘箱中烘30min以上)上，快速盖上尺寸盖玻片，制备若干水琼脂平面(可置于铺有湿润滤纸的10cm*10cm塑料培养皿中封口保存约d)。

(C)血球计数板计算浓缩孢悬液浓度，无菌水稀释，制备浓度为10⁵～10⁶/ml 的印迹液。

(D)干净锋利的手术刀灼烧灭菌，将琼脂平面切除厚度不均的边缘，随后分块为1～3mm的小块，进而用内径0.3mm的毛细管吸取一定量涡旋均匀的上述步骤(C)的印迹液，在水琼脂废料上印迹几次，保证随后印迹的稳定性，保持毛细管水平或者略向上倾斜15°角，琼脂平面与毛细管成垂直的状态下，对每个小块印迹。