[发明专利]一种高效生防促生人参复合微生物菌肥制备方法

权利要求书

1.一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，非常适宜非林地生态种植人参的复合微生物菌肥，是一种微生物多抗生防菌肥制备技术方法；其特征在于为了解决现有非林地栽培人参主要通过使用化肥农药等手段来实现达到提高人参产量的目的，而提供一种复合微生物菌肥具有防治人参病虫害发生的同时且能有效促进人参对大量营养成分的吸收等高效能，它的优点是具有缓释性和持效性可高效地持续地供给植物苗木生长，提高了土壤中大量营养元素氮、磷、钾的利用率，进而促进人参等药用苗木的健康高质量快速生长的复合微生物菌肥制备方法是按以下步骤完成的：

一、采集：①、采集时间：在秋季待人参收货期进行采集，此时人参根系营养成分处于较高水平状态；②、选择要求：选择长势健壮良好、无病害的4~6年生人参，苗高为39~47cm、静止时根系长度大于10cm、静止时根系宽度为1~3cm、且无病害的非林地栽参土壤的人参根际土种；③、采集要求：采集时去掉人参地表枯枝落叶层，连人参苗根系周围的土坨一并挖出、小心取出参根，将其根际土小心抖落后收集到无菌的50ml离心管内且密封好，同时把干冰放在该离心管外边以保证人参根际土种的含水率和化学成分不受影响以及不被病菌病虫害感染的良好环境；④、贮存：人参根系的土种在4℃下保存，备用；

二、筛选分离：①、筛选：精确称取1g五年长势健壮良好、无病害的人参根际土壤加入到100ml无菌水中，然后在温控回旋立式双层振荡器（生产厂家为上海智城分析仪器制造有限公司，产品型号为ZWY-11128，温控范围为+4~60℃，温度分辨率为0.1℃，转速范围为30~300r/min）里震荡，摇床条件设置为200r/min，充分震荡2h混匀后静置1h，将其制备成为悬浊液，然后梯度稀释至10-3、10-4、10-5后，分别涂布于pH为6.8~7.0固氮菌分离培养基（每1000ml培养基中加入蔗糖5g、七水硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、琼脂20g）、pH为7.2~7.4解磷菌分离培养基（每1000ml培养基中加入葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、氯化钠0.5g、酵母粉 0.5g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.5g、卵磷脂0.2g、碳酸钙1.0g、琼脂20g）、pH为7.0~7.4解钾菌分离培养基（每1000ml培养基中加入蔗糖3g、磷酸氢二钠2g、七水合硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、琼脂20g）各稀释梯度设3个重复，置于温控回旋立式双层振荡器里温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h直至单菌落出现，分别选择在固氮菌分离培养基、解磷菌分离培养基、解钾菌分离培养基上出现透明圈且菌落生长迅速、活性高、菌落较大的菌落，进行分离纯化3次以上至获得纯培养，4℃条件下保存，备用；②、菌株培养：先将一种菌液涂布至pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，再使用另一种菌液再平板上划线，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h后得到两种菌株样品；③、种子液制备：使用接种环挑取固体培养基上的菌落，接种至pH为7.0液体LB培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g）中，置于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200r/min、温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h即可得到种子液样品；、复合微生物菌液制备：分别将1ml菌株种子液接种至100ml液体LB培养基中，置于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h即可得到复合微生物菌液样品；该复合微生物菌液样品经菌种分子鉴定，其结果是成功培养了4种抗逆性强、增殖能力强新的人参菌株，分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus_subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、海洋芽孢杆菌（Oceanobacillussp.）、芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp），与此同时亲和性试验结果为这四种人参菌株中两两之间无拮抗作用且菌株种子液比例为1:1:1:1；

三、复合微生物菌肥制备：①、复合微生物菌液生长的碳源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（蔗糖1%、蛋白胨2%、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅（生产厂家为上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号为YXQ-LS-75S，压力为0.25MPa，功率为3500w，工作温度为135/138℃）灭菌温度设置为 121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达13.67×109 CFU·ml-1；②、复合微生物菌液生长的氮源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（1%蔗糖、2%牛肉膏、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅灭菌温度设置为121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，最后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达14.27×109 CFU·ml-1；③、复合微生物菌肥配制：以复合微生物菌液生长条件为碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%，该条件下复合微生物菌肥中活菌数可达16.67×109 CFU·ml^-1；以重量份数进行配制复合微生物菌肥100份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌25份、海洋芽孢杆菌25份、芽孢杆菌属细菌25份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为1:1:1:1。