[发明专利]一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法

权利要求书

1.一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将目标组织用机械法切碎加入组织消化酶进行组织解离，所得组织解离液经过滤得到组织细胞悬液；

B、对所述组织细胞悬液依次进行差速离心、超离、SEC排阻和超滤，进行组织胞外囊泡的富集纯化；

其中，所述组织消化酶为消化酶H、消化酶R和消化酶A的混合酶；

步骤B包括：

B1、向所述组织细胞悬液中加入20～40uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，混匀，2～8℃200～1000g离心5～30min，收集上清液；

B2、将B1所得上清液转移到新的离心管中，2～8℃1000～5000g离心5～30min，收集上清液；

B3、将B2所得上清液转移到新的离心管中，2～8℃8000～15000g离心5～30min，收集上清液；

B4、将B3所得上清液用0.22μm滤膜过滤到超离管中，加入预冷的PBS至总体积10～18mL，2～8℃100000～150000g超离1.5～2.5h；

B5、将超离管中的沉淀用0.5～2mL PBS溶解，得到初步纯化的组织胞外囊泡悬液；

B6、将上述组织胞外囊泡悬液加入到排阻色谱柱中，待液体流尽，加入2～3mL PBS，与此同时开始收集流出液；

B7、将B6中的流出液转移到超滤管中，4℃3000～5000g离心1～5min，留取截留液200～500uL，即为高纯度组织胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括：

A1、将冷冻的目标组织置于冰预冷的培养皿中，培养皿放置在干冰上；

A2、用刀片在干冰上放置的培养皿中切组织，得到组织切片；

A3、将组织切片转移到含有组织消化酶的离心管中，于35～38℃孵育，期间振荡使组织完全解离，得到组织解离液；

A4、用50～100μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，得到组织细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，A2中所述组织切片大小为0.5～5mm³。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，A3中所述组织消化酶的用量为1.5～4mL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，A3中于35～38℃水浴孵育10～60min，每隔3～8min混合振荡一次。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述目标组织来自胃癌组织、肝癌组织、脑癌组织、乳腺癌组织、肺癌组织、淋巴结癌组织、动脉粥样硬化组织、胃组织、肝组织、脑组织、肾组织、乳腺组织、肺组织、淋巴结组织、腹膜组织、心脏组织。