[发明专利]一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法

说明书

本发明提供了一种大熊猫乳汁冻存液，所述冻存液的基础液是乳汁细胞培养液Low‑Glucose DMEM，并含有如下浓度的成分：天然蜂蜜1.4M，海藻糖0.7M，果糖5mM，白藜芦醇100μM。本发明还提供了一种大熊猫乳汁的保存方法。本申请中，将乳汁营养成分和细胞分开保存，在使用时将两者分别解冻并按比例混匀，能够满足大熊猫幼仔的哺乳需求。本申请为了保证大熊猫乳汁细胞的活性，采用了特殊的冷冻保护剂。通过本发明的新型细胞冻存液，细胞解冻后活力为90.27％，完全满足上述实际生产需求。

技术领域

本发明涉及一种冻存液及动物乳汁的保存方法，具体涉及一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法。

背景技术

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)为我国特有的珍稀动物，亦是世界自然保护的旗舰物种。提高大熊猫繁殖与育幼成功率一直是圈养大熊猫保护工作的重点，也是研究的难点。大熊猫幼仔均为早产出生，其后期发育完全依赖于母乳喂养，所以母乳质量的好坏是决定幼仔能否健康存活的关键因素。大熊猫母乳成分复杂多样，生物学功能较多，不仅为幼仔的生长发育提供营养物质还具有免疫保护功能。之前的一些研究曾对圈养大熊猫母乳中的部分概略养分、乳糖、维生素、矿物元素、乳蛋白、酶活力与激素、免疫球蛋白、氨基酸、差异表达的乳清蛋白等非细胞成分及含量进行了分析测定，但除此之外，最新的研究发现，大熊猫乳汁中含有不同类型的细胞成分，对幼仔的发育有重要作用。大熊猫会有较大的概率生产双胞胎，但其产后泌乳量难以满足2仔的快速生长发育需要，多数母兽只能养好1仔，个别母兽甚至1仔也不喂养，这种情况需要进行人工辅助育幼。如何保存大熊猫乳汁尽可能维持乳汁品质对于人工育幼至关重要。

目前常规的大熊猫乳汁冷冻采用的液氮直投法，即将乳汁装入冻存管中，直接投入液氮中。后续对冻存的乳汁进行系统检测后发现，液氮直投法冻存的乳汁营养成分保存较好，但是乳汁中的细胞损失严重，仅有约6％的冻存活率，显然不利于大熊猫幼仔的健康发育，因此，从实际生产需要出发，急需建立新型大熊猫乳汁冷冻保存方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冻存液和大熊猫乳汁冷冻保存方法，既能提高细胞冻存活率，又能保证冻后的乳汁安全性，无毒且可供幼仔食用，保证大熊猫幼仔健康发育。

本发明具体是这样实现的：

一种大熊猫乳汁冻存液，所述冻存液的基础液是乳汁细胞培养液Low-GlucoseDMEM，并含有如下浓度的成分：

天然蜂蜜1.4M，海藻糖0.7M，果糖5mM，白藜芦醇100μM。

更进一步的方案是：

所述冻存液经过过滤除菌，并保持冻存液渗透压2100±50mOsm/kg，pH＝7.5。

本发明还提供了一种大熊猫乳汁的保存方法，包括如下步骤：

步骤一、将大熊猫乳汁在630G离心10分钟，收集上清液为乳汁营养成分，装入冻存管内并投入液氮中保存；

步骤二、下层沉淀部分为乳汁细胞成分，用含有5％抗生素的PBS重悬，630G离心10分钟清洗细胞，并重复一次；通过清洗可以消除在人工采集乳汁过程中的细菌污染及一些杂物；

步骤三、按照1×10⁶～10⁷个/mL的标准调整乳汁细胞的数量，然后加入1mL大熊猫乳汁冻存液，轻柔混匀并转移至1.8mL冻存管中，将冻存管放入程序冷冻盒后放置-80℃冰箱中，24小时后转移至液氮中长期保存。

更进一步的方案是：

所述抗生素为青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)溶液。