[发明专利]用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒

说明书

本发明涉及基因工程及肿瘤学技术领域，提供了用于卵巢癌诊断的miRNA标志物，包括miRNA‑210、miRNA‑200b、miRNA‑21和cel‑miR‑39中的一种或多种；miRNA标志物的序列依次为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。该标志物可以区分卵巢良性卵巢肿瘤和卵巢癌；对鉴定不同FIGO分期的卵巢癌患者有指导作用；并且比常规生物标志物CA125能更好地区分卵巢癌患者和卵巢良性肿瘤患者。本发明还提供了基于以上miRNA标志物的用于卵巢癌的诊断试剂盒，在反应体系中加入氧化石墨烯，能显著提高检测卵巢癌时的灵敏度和特异性，提高诊断效率。

技术领域

本发明涉及基因工程及肿瘤学技术领域，具体而言，涉及用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒。

背景技术

卵巢癌是三大妇科恶性肿瘤之一，占女性所有肿瘤疾病的4％。由于卵巢处于盆腔深部故发病隐匿且早期无症状，约70％的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存率低于30％，而早期卵巢癌患者5年生存率可达90％以上。因此，越早精确诊断越能在早期有效控制病情并提高临床治疗的有效性。目前的临床实验诊断技术主要利用免疫学检查和病理检查进行卵巢癌的联合诊断。免疫学检查中血清糖类抗原CA125是目前临床应用最多的卵巢癌血清标志物，常用于对晚期卵巢癌进行辅助诊断和监测卵巢癌的复发，近年来也被用于早期诊断卵巢癌。但由于仅50％早期卵巢癌患者血清CA125水平会升高，另存在少数卵巢良性疾病也可伴有血清CA125水平升高，因此血清CA125测定对早期卵巢癌的诊断敏感度、特异度及相关组织特异性均有限，且存在较高的假阳性率。此外，常规的病理检查也存在取样困难等缺点，不适于卵巢癌的早期诊断。因此，迫切需要新的诊断生物标志物和技术来完成卵巢癌的早期诊断。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为18-24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，对约30％人类蛋白的表达具有调节作用，参与调控细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。miRNA在多种肿瘤组织中均有特异性的表达谱，参与肿瘤发生、发展、转移的各个阶段，且每一个阶段都有相应的基因发生改变，同时也有调控这些基因的miRNA发生变化。这些异常表达的miRNA在卵巢癌患者的血浆、血清和其他体液中也能被检测到。由于其在体液中的稳定性和对内源性核糖核酸酶的抵抗力，miRNA有望成为卵巢癌的无/微创诊断和预后生物标志物。

最常用的miRNA检测技术是实时荧光定量PCR(Real-time FluorescenceQuantitative PCR,qRT-PCR)，它是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，通过对循环阈值和标准曲线的分析，进而对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。然而，当模板含量过低时，qRT-PCR易出现假阳性结果及非特异性扩增，导致定量不准确。近年来，有研究旨在提升qRT-PCR的性能，以获得更精确的结果。例如：有研究报道，利用C60可提高qRT-PCR的性能(C60 affects DNA replication in vitro bydecreasing the melting temperature of DNA templates,2009,47,1457-1465)；但C60的制作步骤极复杂，成品C60价格又极高，难以在qRT-PCR应用中推广。又有专利报道将石墨烯应用于传统PCR可提高传统PCR的特异性，改善传统PCR的综合优化效果(专利公开号：CN102978201A)；石墨烯能提高PCR特异性是由于其表面全为sp2共轭区域，能够通过π-π共轭吸附单链DNA，减少PCR过程中非特异性扩增的发生；但相较于传统PCR，qRT-PCR要求更为严格，因为qRT-PCR中使用的荧光染料分子(或基团)本身和sp2区域间能形成π-π共轭从而淬灭荧光染料分子的荧光，可导致qRT-PCR检测不到荧光信号，因而难以直接将石墨烯应用于qRT-PCR。