[发明专利]野生氧化酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及医药化学领域，特别是涉及药物中间体的制备领域，更为具体的说是涉及野生氧化酶突变体及其制备方法和应用。所述野生氧化酶突变体为NADH依赖型氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明公开的野生氧化酶突变体能够高效氧化生成(4R‑cis)‑6‑甲醛基‑2,2二甲基‑1,3‑二氧六环‑4‑乙酸叔丁酯。不仅反应条件温和，而且在辅酶系统参与下可以达到无副产物产生的效果，对环境友好，是一种经济、高效的制备方法。

技术领域

本发明涉及医药化学领域，特别是涉及药物中间体的制备领域，更为具体的说是涉及野生氧化酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

2-((4R,6S)-6-甲醛基-2,2-二甲基-1,3二氧六环-4-基)-乙酸甲酯是一种重要的药物中间体化合物。目前，合成2-((4R,6S)-6-甲醛基-2,2-二甲基-1,3二氧六环-4-基)-乙酸甲酯常用的方法为化学合成法，主要包括两种：

方法一：

该方法需要使用氧气氧化断裂双键，工艺操作复杂、制备成本高、有效转化率低，得到的产物纯度不高。同时，由于原料不易获得，其合成也较为复杂，增大了工业化成本。

方法二：

该方法虽然简化了工艺，但是原料不易获得，其合成工艺同样比较复杂，不适合工业化生产。

酶法作为一种生物制备方法，具有副反应产物少、对环境友好、反应条件吻合、操作简单等优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，寻找一种生物制备方法，从而能够替代现有的化学合成方法制备得到药物中间体2-((4R,6S)-6-甲醛基-2,2-二甲基-1,3二氧六环-4-基)-乙酸甲酯。

为了解决上述技术问题，本发明公开了野生氧化酶突变体，所述野生氧化酶突变体为NADH依赖型氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的本发明还公开了含有编码所述野生氧化酶突变体的核酸分子的载体。

优选的，在本发明中所述载体为pET-30a质粒载体。

同时，在本发明中还进一步公开了含有上述的载体的重组菌，优选的，所述重组菌为面包酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的任意一种，优选为大肠杆菌，更为优选的是大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。

同时，在本发明中还进一步公开了前述野生氧化酶突变体的制备方法，该方法以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导前述重组菌，从而得到本发明所说的野生氧化酶突变体。

在一个优选的技术方案中，本发明进一步优选当重组菌培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得野生氧化酶突变体。

最后，本发明还公开了所述的野生氧化酶突变体在式II氧化制备式I中的应用，其反应方程式如下：

其中氧化酶的形式可以是细胞裂解液中的混合物酶、和/或经提取的粗酶、和/或经过处理的固定化酶。

作为优选，所述氧化反应中使用NAD+作辅因子。

进一步优选的，所述氧化反应中还添加有NADH氧化酶(NOX)，从而能够实现辅酶因子的再生。

作为一种优选，在本发明中还进一步公开了任意选择以下任意一个或者多个优选的反应条件：

a.所述的氧化酶的用量在1～10U/ml；

b.所述NADH氧化酶的用量在0.5～8U/ml；