[发明专利]一种外切型肝素酶及其应用

说明书

本发明涉及一种外切型肝素酶及其应用。本发明中的外切型肝素酶倾向于通过从还原端顺序释放在232nm具有特异紫外吸收的不饱和二糖来降解底物。本发明中的外切型肝素酶从还原端依次切下高硫酸化度的肝素二糖，肝素二糖的硫酸化程度越高，肝素酶的酶活越高。此外，通过用外切型肝素酶exoHep对HP八糖进行初步测序，证明了外切型肝素酶在HP/HS结构研究中的潜力。本发明不仅填补了肝素酶研究领域的空白，而且为HP/HS的结构和功能研究和酶解测序提供了新型的工具酶。

技术领域

本发明涉及一种外切型肝素酶及其应用，属于生物酶技术领域。

背景技术

肝素(HP)/硫酸乙酰肝素(HS)是一类聚阴离子直链多糖，结构具有高度不均一性，是一类重要的硫酸化糖胺聚糖。它们广泛存在于细胞膜表面、细胞外基质(ECM)以及细胞内环境中(如肥大细胞)。由于存在复杂多变的结构，使得HP/HS能够与各种蛋白分子(如生长因子和成型素及其受体等)相互作用，通过调节细胞信号转导、黏附、迁移等参与各种重要的生理和病理过程，如抗凝血，细胞黏附，炎症反应，细胞迁移，细胞分化，病原微生物感染，肿瘤发生发展等过程。这些重要的生物学作用引起了人们对HP/HS的极大关注，开展了大量有关HP/HS结构和功能以及临床应用方面的研究。自1916年被发现以来，HP及其低分子制剂作为最重要的抗凝剂已广泛应用于临床治疗。

HP/HS多糖的主链由重复的二糖单元组成，该二糖单元由D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖酸(GlcA/IdoA)和N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)组成。在HP/HS的生物合成过程中，最初合成由重复的二糖GlcA-GlcNAc单元组成的直链多糖前体，然后由多种修饰酶进行进一步修饰。其中N-脱乙酰基酶-N-磺基转移酶和3-O-和6-O-磺基转移酶催化GlcNAc残基的硫酸化；C5-差相异构酶催化GlcA转化为IdoA残基；和2-O-磺基转移酶，催化GlcA/IdoA残基的硫酸化。这些修饰可导致HP/HS多糖中存在种类繁多的二糖单元，使得HP/HS成为自然界中最复杂的天然聚合物。与此同时，高度复杂的结构严重阻碍了人们对HP/HS结构和功能的研究。

细菌来源的肝素酶(Hepase)是一种多糖裂解酶，可特异性地通过β-消除反应催化HP/HS多糖链中GlcNAc和GlcA/IdoA残基之间的糖苷键断裂，从而生成在非还原端含有4,5-不饱和糖醛酸残基的寡糖。肝素酶是研究HP/HS结构和功能必不可少的工具酶。迄今为止，已鉴定的肝素酶根据其底物特异性可分为三种类型：肝素酶I(EC4.2.2.7)，可特异性降解高硫酸化度，富含IdoA的HP；肝素酶III(EC 4.2.2.8)，倾向于降解低硫酸度和富含GlcA的HS；肝素酶II(EC 4.2.2.-)，可同时降解HP和HS。肝素酶I蛋白分子折叠成β-果冻卷型三维结构，倾向于裂解与IdoA2S/GlcA2S连接的1,4糖苷键。相比之下，肝素酶III由一个N端(α/α)₅桶形结构域和一个C端反平行β夹心结构域组成，它倾向于裂解与GlcA/IdoA连接的1,4糖苷键。肝素酶II采用类似于肝素酶III的拓扑结构，对特定的GlcA/IdoA或IdoA2S/GlcA2S结构没有选择性。上述三类肝素酶催化机制相似，均采用Tyr-His来充当酸和碱来催化糖苷键断裂。

值得注意的是，所有已鉴定的肝素酶(HepaseI，II和III)都属于内切裂解酶家族，它们随机地从HP/HS多糖链内部裂解糖苷键，而HP/HS糖链测序所急需的外切型肝素酶则始终未被发现和鉴定。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种外切型肝素酶及其应用，具有高效的降解肝素类底物的酶活性。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种外切型肝素酶，该酶用于从肝素类底物的还原端依次切下二糖单元。

根据本发明优选的，所述肝素类底物为肝素、硫酸乙酰肝素或HP-F_αIII。