[发明专利]一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法

说明书

一种基于益生菌发酵连续化制备免疫调节组合物的方法，包括以下步骤：（1）固相微生物柱胁迫发酵；（2）膜分离；（3）固相酶柱降解；（4）膜分离；（5）发酵基质套用；（6）膜浓缩；（7）干燥，得到免疫调节组合物。本发明将微生物逆境胁迫应激发酵应用到免疫调节组合物的制备工艺中，得到对免疫系统具有调节功能的组合物；使用微生物柱等设备及错流膜分离、膜浓缩、固相酶柱降解及基质套用等技术进行连续化生产，产品得率高，产品活性高，培养基质和微生物的利用率高，生产效率高，且工艺条件温和，对设备要求较低，适合规模化生产。

技术领域

本发明涉及一种免疫调节组合物的制备方法，具体是一种免疫调节组合物的连续化制备方法。

背景技术

微生物的逆境胁迫应激反应是指当外界环境发生变化时，微生物会产生复杂的生理反应，通过蛋白质复合物的重组或依靠信号转导系统的磷酸化等代谢产物的改变，来适应各种各样的微生态环境的变化。当细胞处于多种环境胁迫时，由一种适应性反应表达所诱导的交互作用，对细胞的生存很有利。微生物在利于其生存的条件下(例如丰富的营养、适宜生长的温度，pH值，渗透压以及氧化还原电势等)，会尽可能地阻遏冗余或非必需蛋白的表达，加速合成生长必需的细胞组分；当生存环境不利于其生存时(例如不适合生长的物化条件、营养不足等)，即在胁迫环境条件下，微生物会将用于生长的资源转而用于合成那些可以抵御压力环境，修复损伤的蛋白。

在逆境胁迫条件下发生的应激反应，不仅可以保护微生物自身不受或者减少胁迫影响，同时也能使微生物分泌具有一定特殊功能的代谢产物。研究发现，乳酸菌在各种胁迫环境下具有自我调控能力，并通过各种生理反应诱导不同数目的蛋白质来适应不利环境。如通用应激蛋白、参与代谢的各种蛋白以及胁迫诱导的特定应激蛋白。其中已研究表明通用应激蛋白可以参与DNA或蛋白质的修复，如侣伴蛋白（DnaK，GroEL，GroES）或蛋白酶 （Clp蛋白酶等)；研究也表明，微生物应激反应的代谢产物，具有激活巨噬细胞释放细胞因子，提高白细胞介素水平和调节免疫细胞分化抗原水平等，对免疫系统调节具有一定的作用。

目前，关于逆境胁迫发酵方法，文献已经有所报道。

CN102162001A公开了一种厌氧发酵丙酮丁醇梭菌产丁醇的方法,其是通过胁迫环境发酵促进合成丁醇。CN111053789A公开了一种调节免疫系统的方法和组合物，其是通过胁迫环境发酵从而产生应激反应而促进微生物合成代谢产物。CN106520596A公开了一种添加过氧化氢胁迫节杆菌发酵产过氧化氢酶的方法，是通过胁迫环境发酵促进过氧化氢酶的合成。这些研究成果表明，通过改变外接发酵环境，通过胁迫环境发酵，迫使微生物产生应激反应，分泌自身保护性代谢产物，这类保护性代谢产物具有特殊的生理活性，对应于人体免疫系统调节具有极为重要的意义。

同时，进一步研究发现，这类应激反应产生的自身保护性代谢产物的功能与其分子量具有一定的关系，即分子量大于1万Da的代谢产物，不具有生理活性甚至具有一定的生理毒性，而分子量低于1万Da的代谢产物具有特殊的生理功能，具有调节免疫活性的功能，且无毒性，分子量小易吸收。所以通过胁迫环境发酵使微生物产生应激反应，并从其代谢产物中分离具有免疫系统调节功能的活性物质，极具商业价值。

微生物发酵的传统设备与工艺为采用发酵罐进行发酵，即罐式发酵，其发酵过程为间歇式，连续化程度低，生产效率低下；同时，发酵结束后，其大量具有活性的微生物和营养丰富的培养基都作为副产物进行处理，资源浪费严重，对环境也造成污染；同时，作为间歇式发酵工艺，其代谢产物由于不能及时分离出来，导致其在发酵罐中不断积累，发酵罐中过多的代谢产物累积会反向抑制发酵，甚至产生有毒有害物质，不利于后续发酵过程的顺利进行。

CN111053789A公开了一种调节免疫系统的方法和组合物，通过培养、胁迫发酵、过滤分离而得到产品，该工艺生产过程为间歇式，连续化程度低，且微生物及基质利用率低，代谢产物未及时提取会反向抑制发酵甚至产生毒害，生产效率低。