[发明专利]毒鼠强纳米抗体及应用

说明书

本发明提供一种毒鼠强纳米抗体及应用。利用毒鼠强人工抗原免疫动物分离外周血的B淋巴细胞，提取其RNA，构建纳米抗体文库，利用噬菌体展示技术，筛选得到毒鼠强纳米抗体。利用本发明提供的毒鼠强纳米抗体能够快速检测样品中的毒鼠强，在毒鼠强酶联免疫吸附法(Enzyme‑linked immunosorbent assay，ELISA)检测方法中，该抗体的IC₅₀值为1.04ng/mL，线性检测范围为0.057‑18.94ng/mL，本发明为实现毒鼠强的低成本、大批量现场检测提供有力工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种毒鼠强纳米抗体及应用。

背景技术

毒鼠强(Tetramethylene，TET)，化学名为四亚甲基二飒四胺，为剧毒速效的灭鼠药，无色、无味，对所有温血动物都有剧毒，性质稳定，不易分解，且尚未有对应的解毒剂，在我国明令禁止生产和使用，但仍有人使用而造成中毒事件。仪器分析方法，如气质联用法等，需要繁琐复杂的前处理过程，且耗时长，面对公共卫生事件难以做到现场快速检测。因此，亟需建立一种简单快速的毒鼠强检测方法。免疫分析法具有简单快速，价格低廉等优势，可以实现大量样品的快速分析，在生物医药、食品健康与残留检测等领域有着广泛的应用。抗体作为免疫检测方法的核心试剂，影响着特异性、灵敏度等多个因素。

1993年，布鲁塞尔的Hamers课题组，首次报道了驼科动物血清中，天然存在缺少轻链的抗体，即重链抗体(Heavy chain antibody，HCAb)。这一发现被报道之后，围绕这种骆驼来源的重链抗体的一系列研究在全世界广泛开展。纳米抗体的抗原识别功能由可变区决定，即为重链抗体的可变区(Variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH)，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体(Single domain antibody，sdAb)，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，高度4nm，因分子量较小(约15KDa)，又被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。与传统抗体相比，纳米抗体具有很多优势，首先，纳米抗体保守的链内二硫键降低了CDR3区域的柔性，使得蛋白稳定性好；其次，有些纳米抗体的CDR3区域明显较长，使得与抗原有更大的接触面积；另外，纳米抗体中FR2区域疏水氨基酸残基被亲水氨基酸取代(Glu49、Arg50等)，因此亲水性比传统抗体高；除了以上几点外，纳米抗体对酸碱、有机溶剂等耐受性强、且其结构简单、易进化改造、成本低等特性弥补了传统抗体的不足。综上，纳米抗体的这些优势，对毒鼠强免疫学检测方法的建立具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的毒鼠强纳米抗体及应用。

为了实现本发明目的，发明人先用毒鼠强人工抗原辅以免疫佐剂进行羊驼免疫，从外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，通过PCR和电转化的方法，构建重组噬菌粒，建立纳米抗体的抗体库。利用噬菌体展示技术，筛选靶向特定抗原的纳米抗体，并从噬菌体库中筛选获得了一种体积小、稳定性强、易克隆、易表达、且可特异性结合毒鼠强的纳米抗体。

第一方面，本发明提供一种毒鼠强纳米抗体，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。

所述毒鼠强纳米抗体的结构分析如图3所示。毒鼠强纳米抗体的结构域包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determiningregion，CDR)。

进一步地，可以将SEQ ID NO:1所示的毒鼠强纳米抗体作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造得到突变体，这些突变体均属于本发明保护范围，以提升纳米抗体的水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等。