[发明专利]一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光型RAA试剂盒及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种检测试剂，其特征在于，所述试剂中含有特异性引物组和RAA-exo探针；

所述特异性引物组用于特异性扩增牛结节性皮肤病病毒ORF132基因；

所述特异性引物组的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-F：5′-TATAMTGGTCTATTTTTAACTTTTTTATGCAAT-3′；

HW-LSD-R：5′-GARAACAACACTTTTTCCTTATCTAAAGAGRC-3′；

所述RAA-exo探针靶向牛结节性皮肤病病毒ORF132基因；

所述RAA-exo探针的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-LP：5′-TAATTCACTTTTAACTTTTTTATTATTAACTCCATCGATACATGTA-3′；

所述RAA-exo探针按照5’至3’的顺序在第31位碱基T后依次连接荧光基团、THF残基、猝灭基团；

所述荧光基团选自FAM、Alexa400和CF400；

所述猝灭基团选自BHQ-1和Eclipso。

2.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求1所述的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、Buffer A、Buffer B、阴性对照和阳性对照；

其中，所述Buffer A为水解缓冲液；

所述Buffer B为醋酸镁溶液。

4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）提取样品DNA；

（2）使用权利要求2或3所述的试剂盒对步骤（1）所得样品DNA进行RAA扩增；

（3）根据扩增结果，判读样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒；

其中，所述RAA扩增体系为：

其中，所述Buffer A为水解缓冲液；

所述Buffer B为醋酸镁溶液；

扩增反应条件为：

37～42℃，40秒；37～42℃，30秒；40个循环；

步骤（3）中判读样品中是否含有牛结节性皮肤病病毒的标准为：

当阳性对照有扩增曲线，且出峰时间≤15min或Ct值≤30；和

阴性对照无扩增曲线，或出峰时间≥20min或Ct值≥40时，

若所述样品出峰时间≤17.5 min或Ct值35，判断为阳性，所述样品含有牛结节性皮肤病病毒；

若所述样品出峰时间≥20 min或Ct值≥40，判断为阴性，所述样品不含有牛结节性皮肤病病毒；

否则，重新检测所述样品。

5.特异性引物组和RAA-exo探针在制备牛结节性皮肤病病毒检测制剂中的应用；

所述特异性引物组用于特异性扩增牛结节性皮肤病病毒ORF132基因；

所述特异性引物组的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-F：5′-TATAMTGGTCTATTTTTAACTTTTTTATGCAAT-3′；

HW-LSD-R：5′-GARAACAACACTTTTTCCTTATCTAAAGAGRC-3′；

所述RAA-exo探针靶向牛结节性皮肤病病毒ORF132基因；

所述RAA-exo探针的核苷酸序列如下所示：

HW-LSD-LP：5′-TAATTCACTTTTAACTTTTTTATTATTAACTCCATCGATACATGTA-3′；

所述RAA-exo探针按照5’至3’的顺序在第31位碱基T后依次连接荧光基团、THF残基、猝灭基团；

所述荧光基团选自FAM、Alexa400和CF400；

所述猝灭基团选自BHQ-1和Eclipso。