[发明专利]一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法

权利要求书

1.一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法，其特征在于，所述方法包括如下A、B和C三个部分：

A、分离胃底腺干细胞：

(1)配制5X冲洗液母液和1X冲洗液，每100mL所述5X冲洗液母液由Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、KCl、蔗糖和山梨糖醇配制而成；所述Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、KCl、蔗糖和山梨糖醇在5X冲洗液母液中的浓度分别为28、40、481、8、217和274.5mM；所述1X冲洗液由5X冲洗液母液用灭菌水稀释而成，并添加二硫代苏糖醇，所述Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、KCl、蔗糖、山梨糖醇和二硫代苏糖醇在1X冲洗液中的浓度分别为5.6、8.0、96.2、1.6、43.4和54.9mM和0.5mM；4℃保存备用；将24孔细胞培养板于37℃预热30min以上，冰上解冻基质胶，备用；

(2)将新鲜的2～3cm²胃组织放入装有冲洗液的培养皿里，用冲洗液洗掉胃组织的污物，然后将胃组织转移到新的装有冲洗液的培养皿内继续清洗2～3次；

(4)将清洗干净的胃组织移到新的干燥的培养皿，剔除黏膜层和肌肉层，然后将含有基底腺的部分放到新的装有冲洗液的培养皿里，用冲洗液冲洗并吸走残余肌肉层和其他杂脂肪；吸走培养皿中的冲洗液，加入新的冲洗液到培养皿，将含有基底腺部分的胃组织片段剪切成2～5mm²的胃组织碎片；

(5)将胃组织碎片转移到50mL无菌无酶离心管中，向离心管中加入冲洗液，使胃组织碎片随重力沉降，弃去上清部分；重复此操作12次以上，至上清干净透明；

(6)将15～25℃20mL温和型解离液加入经步骤(5)处理后的离心管中，重悬胃组织碎片，在200rpm摇床条件下解离15～30min；重悬解离后的胃组织碎片，使胃组织碎片随重力沉降，弃去上清部分，将胃组织碎片沉淀转移到新的培养皿里，用载玻片轻轻按压，分离出未脱落的基底腺体结构，用冲洗液悬浮基底腺体结构；

(7)将重悬的基底腺体结构转移至50mL无菌无酶离心管，使基底腺体结构随重力沉降，弃去上清部分，然后加入新的15～25℃温和型解离液，在200rpm摇床条件下继续解离5～8min，然后在200g，2～8℃，离心3～5min，弃去上清部分；用15mL F12高糖培养基重悬沉淀，吸取10mL悬浮液通过100μm细胞筛网过滤，重复此步骤，获得2～3份滤液；吸取200μl滤液均匀涂抹到6孔细胞培养板的小室内，显微镜下观察，找到含有干细胞结构较多、碎细胞少的滤液，在300g，2～8℃，离心3～5min，弃去上清部分，即得胃底腺含有干细胞的组织结构；

B、配制猪胃类器官培养基：

(8)配制猪胃类器官培养基：所述猪胃类器官培养基由F12高糖培养基、HEPES缓冲液、谷氨酰胺、B27血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、EGF、FGF-10、TGF-βI型受体抑制剂、尼克酰胺、乙醇胺、胃泌素I、Rock激酶抑制剂、Wnt3A条件培养基、WNR-J2条件培养基组成；所述F12高糖培养基、HEPES缓冲液、谷氨酰胺、B27血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、EGF、FGF-10、TGF-βI型受体抑制剂、尼克酰胺、乙醇胺、胃泌素I、Rock激酶抑制剂、Wnt3A条件培养基、WNR-J2条件培养基在猪胃类器官培养基中的浓度或体积百分比含量分别为：HEPES缓冲液10～15mM、谷氨酰胺2mM、B27血清替代物1％、N-乙酰半胱氨酸1mM、EGF 50ng/mL、FGF-10 200ng/mL、TGF-βI型受体抑制剂2μM、尼克酰胺10mM、乙醇胺10μM、胃泌素I10mM、Rock激酶抑制剂10μM、Wnt3A条件培养基40～50％、WNR-J2条件培养基10～20％，其余为F12高糖培养基；

其中，所述Wnt3A条件培养基的制备过程如下：

a)解冻一份液氮冻存的ATCC-L-Wnt3a细胞；用DMEM+10％胎牛血清FBS+0.4mg/mL G418配制成L-Wnt3a基础培养基；

b)将15mL新鲜配制的L-Wnt3a基础培养基加入到T75培养瓶中，加入解冻的L-Wnt3a细胞，放入37℃，5％CO₂培养箱，持续培养直到贴满；

c)将L-Wnt3a传代到4个新的T75培养瓶中，每个瓶子同样添加10mL的新鲜配制的L-Wnt3a基础培养基，继续培养2～3d，直到贴满；

d)收获每个T75瓶贴满后的培养基，每隔24h收集一次，将收获的培养基以1000g、2～8℃条件下离心3～5min；收集上清液，通过0.22μm细胞筛网过滤到新的50mL无菌无酶离心管，得过滤后的培养基；

e)将收获的过滤后的培养基充分混合即Wnt3a条件培养基，按25mL每50mL离心管分装，于-80℃冰箱保存，备用；

所述WNR-J2条件培养基的制备过程如下：

a)制备JM培养基：将猪血清、DMEM高糖培养基和青霉素/链霉素双抗按体积比1:(3～4)：(0.005～0.015)混匀，于4℃保存备用；

b)将10mL JM培养基于37℃水浴预热后转移至T25培养瓶；

c)将冻存的WNR-J2细胞于37℃水浴进行解冻，得WNR-J2细胞溶液；

d)将WNR-J2细胞溶液转移至步骤b)准备的装有JM培养基的T25培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱连续培养2～3d，至细胞完全长满T25培养瓶贴壁融合为止；

e)移除T25培养瓶中的JM培养基；

f)向移除JM培养基后的T25培养瓶中加入1mL温和型无酶解离液，使温和型无酶解离液均匀覆盖T25培养瓶内壁的细胞层表面，于37℃培养箱解离5～8min；

h)在7℃下预热25mL新的JM培养基，并用6mL预热后的JM培养基重选T25培养瓶中的细胞，得细胞悬液，然后将细胞悬液转移至T150培养瓶，再将预热的剩余的19mL JM培养基加入T150培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱培养24h；

i)经步骤h)培养后，移除JM培养基，然后加入25mL SM筛选培养基培养24h，剔除非WNR-J2细胞；

j)经步骤i)培养后，更换SM筛选培养基为25mL新的JM培养基，继续培养WNR-J2细胞，至WNR-J2细胞完全长满T150培养瓶贴壁融合为止；

k)经步骤j)培养后，移除旧的JM培养基，加入120mL新的JM培养基，将所得的WNR-J2细胞悬浮液按25mL每份分装至多个T150培养瓶，再分别于37℃，5％CO2培养箱连续培养2～3d，至WNR-J2细胞完全融合且有WNR-J2细胞聚集脱落为止；

l)经步骤k)培养后，移除旧的JM培养基，再加入25mL新的JM培养基，于37℃，5％CO2培养箱继续培养24h，即得条件培养基；

m)每24h收集一次每个T150培养瓶中的条件培养基到50mL离心管，然后向T150培养瓶中加入25mL新的JM培养基后，于37℃，5％CO₂培养箱继续培养；

n)将收集有条件培养基的离心管于室温、2000g条件下离心5～10min，吸取上清液至储存瓶，于4℃保存；

o)将JM培养基与上清液按体积比1:1混合，配制成体积百分比终浓度为50％的WNR-J2条件培养基；

C.3D胃类器官培养：

(9)用10mL 2～8℃ F12高糖培养基重悬步骤(7)中胃底腺含有干细胞的组织结构，计数；于15～25℃加150μL猪胃类器官培养基到每个离心管中，再加入150μL未稀释的解冻基质胶到每个离心管中，重悬沉淀；得腺体结构悬浮液；

(10)吸取50μL腺体结构悬浮液到提前预热的24孔细胞培养板，于37℃培养箱孵育至基质胶凝固；加入猪胃类器官培养基，于37℃、5％CO₂培养箱，每周更换三次猪胃类器官培养基，5～7d形成复杂的出芽状结构。