[发明专利]用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用

说明书

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用。本发明公开的一组调控基因在肝脏系统高表达的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比，驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力明显增强，持续高水平表达能力增强，适用于重组腺病毒伴随病毒(rAAV)介导的基因治疗。

技术领域

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子、载体及其应用。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，最终实现治疗目的。20世纪90年代以来，基因治疗技术已从实验室研究走向临床实际应用。从单纯的遗传病基因治疗，迅速扩展到肿瘤治疗领域，近年又研究作为抗病毒治疗正在深入研究中。肝脏的基因治疗是将治疗基因导入肝脏，以肝细胞作为生物反应细胞，进行治疗基因表达，产生治疗性蛋白质类进入血循环，达到治疗目的；同时又可以肝脏作为靶器官，治疗肝脏疾病。1992年Wilson等首次成功地进行了肝基因疗法的临床试验，将低密度脂蛋白(LDL)受体的基因导入患家族性高胆固醇血症病人的肝脏，揭开了肝脏基因疗法的序幕。肝脏既可作为基因的生物反应器，又可以作为治疗靶，肝脏的基因治疗对肝炎、肝硬化、肝癌等疾病提供了新的治疗前景。

腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点，近年来，用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点。重组AAV作为基因治疗载体也存在明显缺点，其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如A型血友病致病基因凝血因子Ⅷ，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FⅧ前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。

针对凝血因子Ⅷ基因较大和AAV载体装载基因受容量限制等特点，Lind P.,et al通过用14个氨基酸的衔接肽(SQ序列)替换凝血因子Ⅷ的B结构域(760-1667aa)，将该基因的大小降低40％至4.4kb(Lind P et al.,Eur.J.Biochem.232:19-27,1995)，该B domaindeleted FⅧ(BDD-FⅧ)是目前FⅧ蛋白表达较常采用的版本；Jenny McIntosh.,et al通过在SQ序列中间插入包含6个糖基化位点的17aa短肽V3(V3-FⅧ)来增强该蛋白在体内表达(Jenny McIntosh et al.,BLOOD.121(17)，2013)。但无论是BDD-FⅧ还是V3-FⅧ，其尺寸已经接近rAAV的装载上限，留给调控目的基因表达的调控元件(启动子、Poly A)只有大约300bp的空间。

FⅧ的主要合成场所是肝细胞和肝窦内皮细胞，目前使用rAAV基因治疗血友病A的策略是在缩小目的基因FⅧ的同时，采用小尺寸的肝脏特异性启动子，将启动子、BDD-FⅧ或V3-FⅧ、polyA组装到同一AAV载体有限的空间上，如BIOMARIN公司的BMN270的表达簇为HLP-BDD FⅧ-sPA(ClinicalTrials.gov number,NCT02576795)，SPARK公司的SPK-8011的表达簇为TTRm-BDD FⅧ-Rabbit beta globin poly A(ClinicalTrials.gov number,NCT03003533)，两者均采用的是小尺寸的肝脏特异性启动子驱动目的基因的表达，Ⅰ/Ⅰ期临床试验已经取得了一定的效果(Rangarajan S et al.,The New England journal ofmedicine.2017；Lindsey A.G et al.,Blood.130:604,2017)，其中BIOMARIN的血友病A基因治疗药物BMN270已向EMA提交上市申请。但由于启动子尺寸制约，其启动强度与一些较大尺寸启动子之间还是存在着不小的差距。