[发明专利]一种多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法

权利要求书

1.一种多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：准备材料：Folin-Ciocalteu试剂、没食子酸标准品、考马斯亮蓝染液、蛋白预染Marker、β-巯基乙醇、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠SDS、甘氨酸、POM汁、BB汁、CG汁；

步骤2：没食子酸标准曲线绘制

准确移取没食子酸标准溶液(1000mg/L)2.5、5.0、10.0、15.0、20.0至50.0mL容量瓶中，分别配制成质量浓度为50、100、200、300、400mg/L的溶液，然后加入5.0mL质量浓度为40％的Folin-Ciocalteu试剂，反应8min后分别加入4.0mL7.5％Na₂CO₃溶液，再用去离子水定容至10ml，分别于30℃下反应1.0h，测定提取液在760nm处的吸光值；

步骤3：总酚的测定

使用Folin-Ciocalteu比色法测定POM汁、BB汁和CG汁的总酚量，并表示为每升毫克没食子酸当量，为制备样品，将稀释的500μLPOM汁、BB汁、CG汁和2.5mL稀释的Folin-Ciocalteu试剂在室温下混合8min，随后加入1.5mL的7.5％Na₂CO₃，在暗处培育2小时后，使用紫外可见分光光度计测量样品在760nm处的吸光度；

步骤4：SDS-PAGE电泳；

步骤5：纳米粒度和Zeta电位仪分析。

2.如权利要求1所述的多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，步骤4包括如下步骤：

(1)样品处理：多酚与杏仁提取物的相互作用通过SDS-PAGE电泳进行评估；

(2)上样：一般加样体积为10-15μL，一个孔中加一个样品，同时用已知蛋白分子量的蛋白mark作为对照，一般mark的上样量为3μl；

(3)电泳：连接电泳仪，开启电源，电压调制80V，30min后，等到染料进入分离胶后将电压调制为120V，40-60min，直到染料到达分离胶底部距离下缘1cm左右时，停止电泳；

(4)切胶：取下凝胶板，去除浓缩胶，对照mark的分子量，将分离胶切成合适大小；

(5)考马斯亮蓝染色：将凝胶放入烧杯中，加入超纯水煮沸弃液；配制染液然后加入烧杯中，煮沸4-5min后弃液；

(6)脱色：配制染色液，将染色液倒入烧杯中，煮沸弃液，重复操作，直至凝胶背景清晰可见；

(7)成像：用凝胶成像仪拍照保存。

3.如权利要求2所述的多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，为了制备多酚-杏仁提取物复合物，将1mL(2mg/L)杏仁提取物与9mL不同浓度的POM汁、BB汁、CG汁在室温下混合15分钟，然后将混合物以10000r/min离心5分钟，收集上清液按照4:1:1的比例，将40μL的杏仁复合物、10μL的蛋白上样缓冲液(5X)和10μL的β-巯基乙醇进行混合，放入离心管中，再将离心管用漂子固定放入已经沸腾的水浴锅中，煮沸变性，待10min之后取出，立即放入冰水中。

4.如权利要求3所述的多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，不同浓度为不稀释、3倍稀释、9倍稀释三种浓度。

5.如权利要求2所述的多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，考马斯亮蓝染色中配制的染液材料为250mL乙醇+1.5mL考马斯亮蓝R-250+10％醋酸。

6.如权利要求2所述的多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，脱色中配制的染色液材料为250mL乙醇+75mL冰乙醇，纯水定容到1000mL。

7.如权利要求1所述的多酚类物质脱除杏仁过敏原测定实验方法，其特征在于，步骤5包括如下步骤：

(1)样品处理：将1mL(2mg/L)杏仁提取物与9mL的POM汁、BB汁、CG汁在室温下混合15分钟，然后将混合物转移到聚苯乙烯比色皿中进行分析；

(2)打开软件，选择菜单测量，出现手动测量设置对话框；

(3)在测量类型下选择大小；

(4)在样品中输入样品信息及注解，为后续图做说明；

(5)一般选择权选择默认设置；

(6)温度设定温度为25℃，平衡时间设置为2分钟；

(7)探测角测量，一般保持默认ZS90选择90度；

(8)测量持续时间-选择自动；

(9)测量次数，选择测量次数为3次；

(10)数据处理-选择一般用途；

(11)点击起点开始运行。