[发明专利]一种新的色氨酸羟化酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种新的色氨酸羟化酶突变体及其应用，属于生物技术领域。所述色氨酸羟化酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO：1所示序列突变形成；所述序列突变的位点选自以下一个或几个氨基酸残基位点：185位、195位、197位、200位、217位、316位、357位、396位、398位、399位、446位和/或447位。本发明通过构建色氨酸羟化酶2(TPH2)突变体的重组工程菌，经发酵和色氨酸催化可以获取5‑羟基色氨酸，并且相对于野生型工程菌，色氨酸羟化酶突变体催化色氨酸产生5‑羟基色氨酸的产量显著提高，从而为降低催化剂的用量、最终降低生产成本提供基础，进而有利于实现5‑羟基色氨酸的工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新的色氨酸羟化酶突变体及其应用。

背景技术

5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)于1958年被发现，是色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase，TPH，也称色氨酸单加氧酶，tryptophan 5-monooxygenase)氧化色氨酸(tryptophan，人体必需氨基酸之一)后形成的氨基酸衍生物。

5-羟基色氨酸在人体代谢中经脱羧反应，可以生成神经递质5-羟色胺(serotonin，5-HT，也称血清素)，在人体中起到减轻忧郁、失眠、食欲不振、体重失调等症状的作用。5-羟色胺在大脑及神经中有大量的分布，是褪黑激素合成的前体。在人体中，褪黑激素与睡眠相关。此前在神经医学中，药品百忧解(Prozac)的作用机理即是减慢人体对5-羟基色氨酸的消耗，从而使人体持续产生5-羟色胺，保持患者情绪愉快、睡眠正常。从另一个角度来讲，直接摄入更多的5-羟基色氨酸将更为有效与健康。此外，5-羟基色氨酸也不会使患者产生抗忧郁药物引发的口干、性欲减退等作用。因此，5-羟基色氨酸可谓此类药物的天然替代品，它的高效合成在现代医药中显得尤为重要，受到了人们广泛关注。

5-羟基色氨酸在加纳树的种子中大量存在。加纳树的树叶和种子自古以来就被非洲地区人民作为药物治疗伤口、肾病及灌肠等，其树皮做成的膏剂也可以治疗皮肤病，其主要活性成分即为5-羟基色氨酸。目前医药业所用的5-羟基色氨酸多从加纳籽中提取，此前多用水热法、醇法或超声法提取。刘岱琳等人采用树脂吸附的方法从加纳籽中分离5-羟基色氨酸，提取率为原料中单位含量的7倍左右。但随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取法获得5-羟基色氨酸变得越来越困难，这也迫使人们寻找合成5-羟基色氨酸的替代方法。

随着加纳树等资源不断减少，以及人们对绿色环保合成工艺的不断重视，通过色氨酸羟化酶催化色氨酸合成5-羟基色氨酸的生物催化或发酵法逐渐引起了人们的关注。采用基因工程和代谢工程方法，提高工程菌中色氨酸合成效率，再通过色氨酸羟化酶催化，获得5-羟基色氨酸。

人类中存在两种不同的色氨酸羟化酶基因，分别位于11和12号染色体，编码两种蛋白(TPH1和TPH2)。TPH1与TPH2是高度同源的蛋白质，序列一致性为71％。TPH1主要在外围组织(periphery)和松果体中表达，而TPH2主要在脑中表达。

研究报道在大肠杆菌中过表达TPH1或TPH2，可以催化色氨酸合成5-羟基色氨酸。但由于色氨酸羟化酶在大肠杆菌中可溶性表达很差，以及羟化酶活性较低等原因，导致5-羟基色氨酸产量较低，无法满足工业化生产需求。色氨酸羟化酶作为催化色氨酸生产5-羟基色氨酸的关键酶，提升色氨酸羟化酶的活性可以提高5-羟基色氨酸的产量、减少催化剂的用量或缩短反应时间，进而降低生产成本，对5-羟基色氨酸的工业化有重要的影响，因此本领域急需提升色氨酸羟化酶的性能，促进5-羟基色氨酸的工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的色氨酸羟化酶突变体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过对野生型色氨酸羟化酶的特定位点进行突变得到色氨酸羟化酶突变体，利用该突变体催化色氨酸生产5-羟基色氨酸的产量明显提高。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：