[发明专利]一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法

权利要求书

1.一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法，其特征在于：它的操作步骤如下：

步骤(一)、从National Center for Biotechnology Information的Gene ExpressionOmnibus数据库中筛选出3个符合条件的小鼠NASH相关模型的lncRNA测序数据集，并下载这些数据集；

步骤(二)、分别对步骤(一)中得到的3个lncRNA测序数据集进行差异lncRNA的表达分析，得到3组差异表达lncRNA；取3组差异表达lncRNA的交集，得到在小鼠NASH中差异表达的lncRNA；

步骤(三)、根据文献资料，构建蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠NASH模型，并记录小鼠体重；小鼠NASH模型构建成功后，进行小鼠眼球取血并通过颈椎脱臼法处死小鼠，进行解剖取组织样，一部分用甲醛固定，一部分放-80摄氏度冰箱保存待用；

步骤(四)、将步骤(三)中得到的血清进行甘油三脂和总胆固醇的检测，得到小鼠NASH模型中的血清学指标，再次确认小鼠模型构建成功；

步骤(五)、将步骤(三)中得到的一部分用甲醛固定小鼠肝组织进行苏木精伊红染色和油红染色，检测NASH模型鼠肝脏中脂质积累情况；

步骤(六)、将步骤(三)中得到的一部分放-80摄氏度冰箱保存待用的小鼠肝组织分别提取总RNA；

步骤(七)、将步骤(六)中得到的小鼠肝组织总RNA进行反转录；

步骤(八)、以步骤(七)中得到的反转录产物为模板，检测步骤(二)中得到小鼠NASH中差异表达的lncRNA；

步骤(九)、将步骤(八)中得到的lncRNA表达结果与步骤(二)中的表达结果进行比对，选取表达趋势一致，且表达差异最明显的3种lncRNA作为判断非酒精性脂肪性肝炎的标志物。

2.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法，其特征在于：步骤(一)中所述的测序数据集，是从GEO数据库中搜索的数据集，经过条件筛选得到，筛选条件为：NAFLD、lncRNA或NASH、lncRNA；每个数据集要包含正常组和处理组样本；每个数据集处理后有一个数据矩阵，行名为lncRNA名称，列名为样本名称。

3.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法，其特征在于：步骤(二)中分别对得到的3个lncRNA测序数据集分别进行差异lncRNA的表达分析，利用R语言中limma包进行差异lncRNA的表达数据分析，上述差异lncRNA表达分析的阈值条件均设置为：|log₂FC|1，且FDR0.05；FC为差异倍数，FDR为伪发现率；满足阈值条件的基因为差异表达基因；分别得到3组差异表达的lncRNA。

4.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(二)中得到的小鼠NASH中都差异表达的lncRNA包括MALAT、NONMMUT018086、NONMMUT057558、NONMMUT047819、NONMMUT015697、NONMMUT061275、NONMMUT013553。

5.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法，其特征在于：步骤(三)中的小鼠NASH模型是利用MCD饮食诱导构建的，周期为2-3周，所用小鼠为6-8周的C57BL/6J小鼠；血样是通过小鼠眼球取血获得，分为两份，一份用于检测血样中的甘油三脂TG、总胆固醇含量TC、天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶含量；另一份用于检测血样中的lncRNA。

6.根据权利要求1所述的一种非酒精性脂肪性肝炎的lncRNA标志物的制备方法，其特征在于：步骤(九)中所检测lncRNA在NASH小鼠模型肝脏中的表达趋势与步骤(二)中得到的在小鼠NASH中差异表达的lncRNA表达趋势一致，分别是NONMMUT015697、NONMMUT061275和NONMMUT013553这三种lncRNA、MALAT1和Lnc-Snhg1作为检测中的阳性对照。