[发明专利]一种NRP1配体的修饰技术

权利要求书

1.一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：NRP1-L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1-L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)；

步骤2：NRP1-L病毒载体的构建：计数3×10⁶个293T细胞，悬浮于10ml无血清DMEM培养基，接种在10cm培养皿上，待细胞贴壁占培养皿总面积50％以上后进行转染；将TCR慢病毒载体和慢病毒包装质粒pmd2.G、pSPAX2以2：1：1的比例混合，转染到293T细胞，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内孵育；转染24小时后更换一次新鲜DMEM培养基，72小时收集包含病毒的培养上清，分装冻存；

步骤3：NRP1-L修饰Jurkat细胞的转染及培养：计数Jurkat细胞，加入10％FBS/RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，每孔1ml；加入500μL病毒上清液，添加精蛋白硫酸盐(终浓度8μg/ml)，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内孵育2小时；离心弃病毒上清液，添加1ml 10％FBS/RPMI-1640培养基，置于细胞培养箱内培养3天；

步骤4：NRP1-L修饰Jurkat细胞的培养及扩增：取1×10⁶个细胞进行NRP1-L抗体染色，流式细胞术检测NRP1-L/GFP双阳性细胞的比例，鉴定感染效率，同时GFP转染Jurkat细胞作为对照；将培养孔中细胞转移至T25培养瓶中扩增，添加10％FBS/RPMI-1640配置培养基至10ml，置于细胞培养箱内培养3天；

步骤5：构建3D细胞球(three-dimensional spheroid)模型：取1×10⁴个293T细胞，种植于超低吸附96孔板，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱内培养，直至24小时后；

步骤6：Jurkat细胞浸润3D细胞球：分别取1×10⁴、3×10⁴、6×10⁴个NRP1-L修饰Jurkat细胞，加入3D细胞球中，共培养48小时；

步骤7：高内涵显微镜分析Jurkat细胞在3D细胞球内部的分布情况：48小时后，PBS清洗3D细胞球3次，用高内涵显微镜断层扫描3D细胞球内部GFP荧光细胞的分布，通过统计荧光总体强度，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat处理组3D细胞球内部GFP荧光强度均显著强于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat；

步骤8：流式细胞术分析3D细胞球内部Jurkat细胞的占比：48小时，PBS清洗3D细胞球3次，加入200微升胰酶消化3分钟，吹打5次将3D细胞球吹散成单细胞悬液，通过流式细胞术分析单细胞悬液中Jurkat细胞的占比，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat在3D细胞球内部细胞数量占比均显著高于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat。