[发明专利]一种有效脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法

权利要求书

1.一种有效脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)、茎尖培养脱毒：

剪取甘薯芽端顶部2cm～3cm长的茎段，剪去已经展开的叶片，倒入洗衣粉用刷子进行洗涤，流水冲洗30min；在无菌操作台上用70％的酒精浸泡30s，再用2％的次氯酸钠消毒5分钟，无菌水冲洗3次，得到消毒后的芽段；

在解剖镜下对消毒后的芽段进行剥离茎尖处理，剪去较小未展开叶片和较大的叶原基，切下带有1～2个叶原基的生长点，长度为0.2mm～0.3mm，用解剖针将茎尖挑到装有培养基的三角瓶中进行茎尖培养，每接种一个茎尖换一次手术刀及解剖针，以降低污染；茎尖培养的培养基为MS基本培养基加入6-BA 1.0mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH值5.8；培养条件为温度25℃、光照强度2000Lx、光照时间12h/d；培养30d后转到MSO培养基分化成苗；

(2)、病毒检测：

当步骤(1)中培养的茎尖苗分化成两棵以上，采叶子4～6片采用RT-PCR检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒；所述RT-PCR的程序为：预变性：94℃ 5min；变性：94℃ 30s；复性：60℃ 30s；延伸：72℃ 60s；30个循环；最后延伸：72℃ 10min；

经检测得到的脱毒苗直接用于组培苗生产；经检测得到的带毒的组培苗进入高温处理和抗病毒药剂处理；

(3)、高温处理或抗病毒药剂处理：

对步骤(2)中经检测得到的带毒的组培苗进行高温处理或抗病毒药剂处理；

其中高温处理的具体步骤为：在40℃条件下处理2h～8h后，按照步骤(2)进行病毒检测，得到脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的组培苗；

其中抗病毒药剂处理的具体步骤为：在带毒的组培苗培养基中分别加入50mg/L～200mg/L的毒氟磷、阿泰灵、新奥甘肽或宁南霉素培养1个月～5个月，按照步骤(2)进行病毒检测，得到脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的组培苗。

2.根据权利要求1所述的一种有效脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法，其特征在于，在步骤(1)茎尖培养脱毒步骤之前还包括接种材料处理步骤，具体步骤为：将甘薯薯块萌发苗或扦插苗进行盆栽，盆栽基质为草炭与蛭石以1∶1比例混合；甘薯苗达到20cm～30cm时，开始取样开展茎尖培养。

3.根据权利要求1所述的一种有效脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RT-PCR检测的引物为：

SPFMV F 5-GGATTAYGGTGTTGACGAC-3，

SPFMV R 5-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3；

SPLCV F 5-CCCCKGTGCGWRAATCCAT-3，

SPLCV R 5-ATCCVAAYWTYCAGGGAGCTAA-3。