[发明专利]磷酸基嵌入杂原子掺杂石墨烯层的仿生酶制备方法及仿生酶和应用

说明书

本发明公开了磷酸基嵌入杂原子掺杂石墨烯层的仿生酶制备方法及仿生酶和应用，具体将杂原子掺杂石墨烯分散于硫酸盐溶液中，再加入磷酸盐，加入碱将溶液pH值调至中性，然后搅拌下反应使磷酸基嵌入杂原子掺杂石墨烯层中，反应毕用水和无水乙醇清洗，干燥得磷酸基嵌入杂原子掺杂石墨烯层的仿生酶；利用杂原子掺杂石墨烯的层间距大小可允许磷酸盐进入，从而增加仿生酶的反应活性位点，加速电子传递，使以制备的仿生酶为原料构建的电化学传感器具有响应迅速、灵敏度高、检测限低和选择性好的优点；在实时定量检测超氧阴离子自由基时，显示出了更高的性能，能够在实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及材料领域，具体涉及磷酸基嵌入杂原子掺杂石墨烯层的仿生酶制备方法，还涉及由该方法制得的仿生酶和应用。

背景技术

超氧阴离子(O₂^.-)是氧分子受单一电子还原的产物，也是细胞在氧代谢过程中最先形成的自由基，其它所有活性氧(ROS)都是从O₂^.-衍生而来的。O₂^.-的浓度波动与诸多生物学过程和疾病的发生发展密切相关。正常生理状态下，O₂^.-在细胞内的浓度会被控制在较低的范围内并保持相对稳定的动态平衡，能协助细胞进行正常的生长和新陈代谢，且具有独特的生理作用。其生理作用主要包括参与抗感染免疫；协助清除褪变、突变和衰老的细胞；参与合成前列腺素、甲状腺素和凝血酶原；参与药物和毒物的解毒等。适度水平下，O₂.^-在细胞内的浓度降低或升高，会导致细胞产生一些瞬间变化，包括生殖能力减弱及防御能力降低等。与此同时，细胞也会启动自我修复和调节机制，不会产生不可逆损伤。但是当细胞产生过量O₂^.-时，会导致一系列毒副作用，对细胞造成不可逆的氧化损伤并对特定信号通路产生影响，包括引起自由基失活、损伤脱氧核糖核酸(DNA)、造成基因突变、对氨基酸及蛋白质造成损伤、以及其他生物分子的损伤等。这些毒副作用对机体的影响进一步引起生理病变，包括生物体的衰老、神经元退变疾病、心血管疾病、癌症等。因此，对活细胞释放的O₂.^-进行定量检测，不仅能更全面了解其在细胞生理活动中的作用，更有助于我们揭示与其相关疾病的发生机制，从而提供在病理学认知下的可靠疾病诊断。

然而，O₂.^-的细胞释放浓度很低且活性极高，对其定性定量检测十分困难。在诸多检测方法中，电化学方法表现出响应快、灵敏度高、操作简易、成本低等优点，非常适合在避免对活细胞新陈代谢和相关生理活动造成破坏的前提下，用于对活细胞实时释放O₂.^-的浓度检测。因此，设计合成具有高灵敏度、高选择性、低检测限、成本低廉的O₂.^-电化学生物传感器成为目前研究的重点和难点之一。传统O₂^.-电化学传感器的敏感元件主要依赖于天然生物酶，而生物酶存在极易受到温度、湿度和pH等影响而导致其丧失催化活性的问题，且其成本相对较高。所以，开发基于仿生酶的新型O₂.^-电化学传感器更具现实意义。

由于超氧化物歧化酶(SOD)是O₂.^-的专一性酶，所以基于SOD构建的O₂.^-电化学传感器能表现出优于其他生物酶的抗干扰能力，但其价格昂贵、产量低且易失活，故而关于能够有效替代SOD的仿生酶的研发，已成为多学科交叉的重点研究问题。近年来，科学家发现通过模仿天然酶的结合位点或活性位点，可以实现对基于仿生酶的电化学传感器的构建，尤其是结合了纳米科技的新型特殊纳米结构仿生酶，能够在生理条件下催化酶底物的反应，具有如同天然酶一样的催化效率和酶促反应动力性质。