[发明专利]十字花科蔬菜黑胫病菌独行菜变种实时荧光PCR检测用引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了十字花科蔬菜黑胫病菌独行菜变种(Leptosphaeria maculans subsp.lepidii)实时荧光PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。本发明根据L.maculans subsp.lepidii与其近似种的ITS序列的差异，设计并筛选出的一组特异引物和探针，建立了L.maculans subsp.lepidii的实时荧光PCR方法检测。本方法特异性好、灵敏度高、重复性好，能快速、方便、高效地检测进境粮油种子及其下脚料中携带的L.maculans subsp.lepidii。本试剂盒在口岸检疫的快速检测和大田农业的监测预警方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及植物病原菌分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及十字花科蔬菜黑胫病菌独行菜变种的实时荧光PCR检测用引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

十字花科蔬菜黑胫病菌Leptosphaeria maculans是我国进境植物检疫性真菌。该病菌包括两个亚种，L.maculans subsp.brassicae和L.maculans subsp.lepidii，前者寄主为栽培芸薹属Brassica spp.又称油菜茎基溃疡病菌；后者寄主为独行菜属Lepidiumspp.。二者在菌落形态、分生孢子等形态特征上非常相似；分子检测上，DNA序列相似度高，序列比对难以区分，容易造成鉴定上的困难。目前L. maculans subsp.lepidii的信息资料极少，潜在风险未知，但海关口岸多次截获的其近似种——油菜茎基溃疡病菌，曾造成欧洲、美洲和澳洲油菜籽严重减产 20％-60％，直接经济损失达9亿美元。2016年重庆口岸从美国进口的大豆中连续两次检出L.maculans subsp.Lepidii，致病性测定试验中发现，该病菌除了侵染独行菜属植物外，还可以引起油菜、萝卜等十字花科蔬菜及大豆等粮油作物发病。L.maculans subsp.lepidii在我国尚无分布，但其可随进境粮油种子及下脚料传入，具有潜在检疫风险。因此建立快速、高效、准确的L.maculans subsp. Lepidii检测方法，成为预防该病菌传入国内的技术关键。

鉴于L.maculans subsp.Lepidii潜在风险未知，但其近似种的危害严重，而且随着我国进口粮油品种及数量急增，从美国、加拿大、澳大利亚等进口的大豆、油菜籽等携带该有害生物几率大，传入风险高。因此，建议各口岸暂时参照油菜茎基溃疡病菌的检疫管理措施，加大进境粮油及十字花科植物的查验力度，严防该病菌的传入，以保护我国十字花科植物的正常生长。

目前，国内外尚无L.maculans subsp.Lepidii的检测方法。本发明通过对L.maculans subsp.Lepidii及其近似种的ITS基因序列比对并筛选出的一组特异引物和探针，建立了L.maculans subsp.Lepidii的实时荧光PCR检测方法。本发明建立的十字花科蔬菜黑胫病菌独行菜变种实时荧光PCR检测用引物、试剂盒及检测方法，将为口岸检疫检测提供高效技术保障，阻断有害生物入侵途径，为应对可能的生物安全隐患，提升我国蔬菜产品品质,保护我国蔬菜产业的生产和生态安全具重要意义。

发明内容

本发明目的在于，为我国口岸检疫和大田监测预警方面，提供一种快速检测十字花科蔬菜黑胫病菌独行菜变种(L.maculans subsp.lepidii)的实时荧光 PCR检测方法，为此，本发明还提供了用于上述检测方法的引物、探针和配套的试剂盒。

L.maculans subsp.lepidii实时荧光PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的上游引物0.5μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的下游引物0.5μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的Taqman探针0.5μL；