[发明专利]一种重组人干扰素-κ包涵体的纯化和复性方法

说明书

本发明公开了一种重组人干扰素‑κ包涵体的纯化和复性方法。所述方法包括：将人干扰素kappa(hIFN‑κ)的编码基因通过密码子优化转化大肠杆菌，构建基因工程菌，所构建的基因工程菌经诱导，以包涵体的方式高效表达重组人干扰素hIFN‑κ，经过纯化复性，获得高纯度的具有抗病毒活性的hIFN‑κ。本发明的纯化及复性方法实现了88％以上的包涵体纯度和60％以上的hIFN‑κ蛋白收率，操作简单且适于大规模生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组人干扰素-κ包涵体的柱层析复性方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子，其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。其中，I型干扰素家族的多位成员，作为抗病毒药物候选，已经完成临床的药物试验，如重组IFN-α2被应用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗药物，IFN-β被应用于治疗多发性硬化症(MS)。对重症急性呼吸综合征急性期患者联合使用激素与IFN-α治疗，可缩短患者的住院时间，促进肺部病变的吸收，减少对激素的需求量，但不会缩短发热持续时间，而且IFN-α治疗可能与机体持续的炎症反应相关，不利于患者的恢复。

干扰素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，IFN-κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员有约30％的同源性，IFN-员比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN-κ与IFN-α、IFN-β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。目前，已有研究发现编码IFN-κ的基因选择性地在上皮角蛋白细胞中表达，重组hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且所述表达具有种族的特异性。

IFN-κ能够活化干扰素刺激基因，抑制脑心肌炎病毒(ECMV)和人类乳头瘤病毒(HPV)的复制。IFN-κ是一种相对温和的I型干扰素，能有效抑制囊膜病毒的复制，是构成性表达的干扰素成员之一，组成抗病毒的天然免疫屏障，呼吸道给药无明显毒性，能够有效抑制流感病毒PR8、H9N2和H7N9以及寨卡病毒的复制，在降低病毒致病性中发挥重要保护作用，与IFN-α相似，其作用机制主要是通过上调干扰素刺激基因以抑制病毒复制。

目前，对于IFN-κ蛋白的研究相对较少，且从人体中获得IFN-κ蛋白的量远远不能满足科研或临床应用的要求。因此，如何获得高纯度和高收率的IFN-κ蛋白是当前迫切需要解决的问题。在现有技术中，利用大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因，形成包涵体，然后对包涵体复性是一种常用的方法。然而，包涵体蛋白的复性是当前一个重要的难题。传统的复性方法采用稀释、透析等常规操作，或者采用低浓度变性剂(盐酸胍或者尿素)洗涤，造成了洗涤过程中包涵体损失较大，产生大量废水，耗时耗能，且IFN-κ蛋白的活性和收率都不高，不利于大规模生产。

因此，针对现有技术中存在的IFN-κ蛋白复性过程存在的问题，提出了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的重组人干扰素-κ包涵体的复性方法，其通过采用含有密码子优化的序列的基因工程菌株，将包涵体的溶解、纯化和复性步骤有机结合，实现了高的包涵体纯度和目标蛋白收率，且包涵体复性后获得具有优异的抗病毒活性的hIFN-κ。

本发明的目的通过包括以下的技术方案来实现：