[发明专利]一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法

说明书

本发明涉及一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法，包括采集带有成熟叶片的杨树健康枝条，浸泡于装满无菌水中，避光保存；在无菌水中，从所述杨树健康枝条的叶柄与枝条连接处剪下叶片，将所述杨树健康枝条的叶柄向下插入所述无菌水中；将所述叶柄固定在离心管中并置于光照度为200μmol m^‑2 s^‑1补光30分钟；测定叶片净光合速率。以毒素处理液中叶片的净光合速率与无菌水对照叶片的净光合速率之间是否出现显著差异及出现显著差异的时间作为评定杨树溃疡病真菌毒素活性的指标。该方法不受自然天气的影响，是一种方便快捷、准确的评定杨树溃疡病真菌毒素活性的方法。

技术领域

本发明属于溃疡病真菌毒素活性检测技术领域，涉及一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法。

背景技术

杨树溃疡病是我国最为重要的树木枝干病害，普遍发生于我国各个杨树适生区。溃疡病主要危害杨树幼苗和幼树，但也在多年生杨树上广泛发生杨树溃疡病造成的持续性灾害，严重影响了我国杨树人工林产业、生态公益林建设的发展。

杨树溃疡病是由溃疡病真菌(Botryosphaeria dothidea)引起的枝干病害。研究表明，病原真菌在生长过程中或与寄主相互作用的过程中会产生真菌毒素，其对寄主的酶、核酸代谢,蛋白质合成等有抑制作用,可引起膜透性增加,使茎的液体流动降低,干扰蒸腾作用并使叶片萎蔫。毒素作为多数病原菌的重要致病因子，被认为可以作为选择压替代病原菌处理寄主植株组织或器官，筛选耐毒素的植株。生物测定是病原真菌毒素测定最传统也是最直接的方法。生物测定通常以毒素对植物造成的伤害为指标，采用完整植株、种子、幼苗、部分器官、愈伤组织、植株细胞或者细胞器等多种材料进行，然而以上方法通常存在实验周期过长，材料制备费时费力等缺点。毒素处理扦插植株、水培枝条、愈伤组织以及苹果、梨果实等方法已经被用于枝干溃疡病菌毒素的生物活性的测定，但是以上测定方法中，从实验处理到毒素危害表型出现，往往需要几天或者更长时间，而且需要消耗大量的实验材料。研究证实，在杨树溃疡病菌、烂皮病菌等枝干真菌病害侵染早期，病原真菌即可显著降低杨树及其他植物叶部组织的净光合速率、气孔导度等生理指标，显示溃疡病菌毒素具有光合抑制活性。基于以上发现，需要一种基于光合参数测定的杨树溃疡病菌毒素生物活性测定的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种利用离体叶片检测杨树溃疡病真菌毒素活性的方法，该方法简单、快捷、准确、实用，并且，不受自然天气的限制，可在任何天气条件下进行测定，为快速准确鉴定杨树溃疡病真菌毒素活性，为快速筛选出抗溃疡病杨树品种、加速抗病育种进程提供有效方法。

本发明提供了一种利用离体叶片杨树溃疡病真菌毒素活性的方法，其包括以下步骤：

(1)采集带有成熟叶片的杨树健康枝条，浸泡于装满无菌水中，避光保存；

(2)在无菌水中，从所述杨树健康枝条的叶柄与枝条连接处剪下叶片，将所述杨树健康枝条的叶柄向下插入所述无菌水中；

(3)将所述叶柄固定在离心管中并置于光照度为200μmol m^-2s^-1补光30分钟；

(4)将叶片转移到含有5.00％毒素的处理液中，分别于10min、30min、50min、70min、90min后测定叶片净光合速率，评定杨树溃疡病真菌毒素活性的指标。

进一步地，以毒素处理液中叶片的净光合速率与无菌水对照叶片的净光合速率之间是否出现显著差异及出现显著差异的时间作为评定指标，测定时间为日照时间。

进一步地，所述的浓度毒素处理液为包含5.00％杨树溃疡病菌毒素的水溶液。

进一步地，所述的杨树溃疡病菌毒素为丙酮沉淀的病菌毒素。

进一步地，净光合速率的测定采用光合系统测定的净光合速率，每个处理选择3株苗木，每株苗木测定2片成熟叶。

附图说明