[发明专利]一种干扰素的制备方法

权利要求书

1.一种干扰素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、分离灰黄层：将100ml血液采入含有抗凝剂的塑料袋内，离心后分离出血浆吸取灰黄层，将吸取的灰黄层，放置4℃冰箱中8-12小时；

步骤2、氯化铵处理：每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入总体积9倍量的冷的0.83％的氯化铵溶液，混匀，40℃放置10min，然后在4℃离心(8，000转/min)20min，弃去溶血上清液，并加入适量的缓冲盐水，收集沉淀的细胞，作成悬液，再用9倍量的0.83％氯化铵液重复处理一次，溶解残存的红细胞，取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞；

步骤3、起动诱生：取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100u/ml，置37℃水浴搅拌培养2h；

步骤4、正式诱生：起动后的白细胞加入仙台病毒，使其最后浓度为100-150血凝单位/ml，在37℃搅拌培养8-12小时；

步骤5、收获：将培养物离心(2，500r/min)30min，吸取上清液即得粗制干扰素，取样作无菌试验并测定效价，每份灰黄层约能制备100万单位的纯化干扰素；

步骤6、纯化：将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾到0.5molL，用2molL盐酸调节pH3-53.5，离心弃去上清液，沉淀A加入原体积1/5量的90-96％冷乙醇，离心弃沉淀，上清液A用盐酸调节pH至5.5，离心弃去沉淀，再调至pH5.8，离心，得上清液B和沉淀B，沉淀B加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液溶解，检测，得干扰素。

2.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤1中所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素、乙二胺四乙酸的一种，400ml血液吸取13-15ml,约为血中细胞的40-50％。

3.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤6中上清液B中加盐酸使pH值降至3,离心,得到沉淀物C,在沉淀物C中加原体积1/5,500量的pH8、0.1mol/L PBS溶解,加NaOH调节pH7-7.5，对PBS透析，静置12小时，离心，收集上清液，检测，得PIEN-A。

4.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤6中上清液B调节pH至8，离心弃去清液，得到沉淀物D，在沉淀物D中加原体积1/50量的0.1mol/LPBSO.5mol/L硫氰化钾溶解，pH降至5.2，离心得上清液C和沉淀物E，沉淀物E加原体积1/2，500量的pH8、0.1molL PBS溶解,调至pH7-7.5，对PBS透析，静置12小时，离心，收集上清液，检测，得PIFN-B。

5.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤2中培养液的基础成分为Eagle’s培养基，其中含4-6％的人血浆蛋白，无磷酸盐，合Tricine 3mg/ml及适量抗生素。

6.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤4中的仙台病毒在10天龄鸡胚中培养48-72h，收获尿囊液获得。

7.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤5中作效价测定的材料在pH2的条件下处理24h后进行检定。

8.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤6中的pH调节剂为盐酸。

9.根据权利要求1所述的一种干扰素的制备方法，其特征在于：步骤6中甘氨酸-盐酸缓冲液的pH为2。