[发明专利]酿酒酵母中延胡索酸酶的提取

说明书

本发明公开了一种延胡索酸酶分离纯化的新工艺；本发明是这样来实现的：将酿酒酵母细胞悬浮液按质量分数4比10悬浮于pH为7.5的100mol/L磷酸钾缓冲液中，分别用珠磨搅拌机和超声冰浴方式进行细胞破碎30min，悬浮液4000rpm离心5min，取上清液调节pH至7.5，弃去沉淀，留上清液加入丙酮低温静置后可见沉淀析出；干燥称量；其活力测定用单位时间苹果酸的减少量表示，紫外可见分光光度计测定330nm波长处的吸光度的增加量。其特征在于细胞破碎时采取超声冰浴方式，可通过超声波的空化作用将存在于亚细胞结构上的酶蛋白分离下来，从而提高分离纯化效率。与普通珠磨搅拌纯化制备方法比较发现超声冰浴破碎细胞方式所得到的延胡索酸酶得率高、活力大。

技术领域：本发明属于生物化学酶的纯化制备领域，具体涉及一种延胡索酸酶的纯化制备方法。

背景技术：延胡索酸酶EC（4.2.1.2.）正式名称为延胡索酸水化酶是催化延胡索酸与水生成L-苹果酸并且可逆进行相互转变反应的酶，最适pH为6.5-8.0，是参与三羧酸循环的酶，因此存在于线粒体基本结构中。工业上主要用来合成苹果酸，医学上患者如果缺乏延胡索酸酶可发生延胡索酸尿；造成脑畸形和严重的智力障碍。分离过程中的工艺步骤对其产品活力有较大影响。

发明内容：本发明涉及一种延胡索酸酶的纯化制备方法。

本发明是这样来实现的：将酿酒酵母细胞悬浮液按质量分数4比10悬浮于pH为7.5的100mol/L磷酸钾缓冲液中，分别用珠磨搅拌机和超声冰浴方式进行细胞破碎30min，悬浮液4000rpm离心5min，取上清液调节pH至7.5，弃去沉淀，留上清液加入丙酮低温静置后可见沉淀析出；干燥称量；其活力测定用单位时间苹果酸的减少量表示，紫外可见分光光度计测定330nm波长处的吸光度的增加量。其特征在于细胞破碎时采取超声冰浴方式，可通过超声波的空化作用将存在于亚细胞结构上的酶蛋白分离下来，从而提高分离纯化效率。与普通珠磨搅拌纯化制备方法比较发现超声冰浴方式所得到的延胡索酸酶得率高、活力大。

具体实施方式：以下通过实施实例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。

实施例1：

配制通过超声冰浴破碎法提取的浓度为10%的延胡索酸酶液，取5mL，加入0.05mol/L苹果酸溶液（pH7.5）10mL；于37℃下准确反应30min，再加入10%三氯醋酸5.0mL终止酶促反应，上清液于330nm波长测定吸光度值。

实施例2：

0-1000μg/mL蛋白质标准曲线的绘制。

分别吸取牛血清蛋白的标准液（1000μg/mL）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，依次加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0mL水，混匀后，分别与5.0mL5%考马斯亮蓝混合，振摇后在595nm测定吸光度值。以吸光度为横坐标，牛血清蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

吸取10%延胡索酸酶1mL同法操作读取吸光度值，标准曲线中查找相应的浓度。

实施例3：

配制通过珠磨搅拌法提取的浓度为10%的延胡索酸酶液，取5mL，加入0.05mol/L 苹果酸溶液（pH7.5）10mL；于37℃下准确反应30min，再加入10%三氯醋酸5.0mL终止酶促反应，上清液于330nm波长测定吸光度值。