[发明专利]一种检测核苷酸大片段缺失的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测n种核苷酸片段缺失在样品中的靶核酸中的存在的方法，其中，n为≥1的整数(例如，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更大的整数)，并且，所述方法包括以下步骤：

(a)针对待检测的每一种核苷酸片段缺失，提供通用引物，以及，第一靶特异性引物对和第二靶特异性引物对；其中，

所述通用引物包含第一通用序列；

第一靶特异性引物对能够扩增野生型靶核酸，并且包含一个正向引物1和一个反向引物1，其中，所述正向引物1包含第二通用序列和特异于所述野生型靶核酸的野生型正向核苷酸序列，且所述野生型正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物1包含第一通用序列和特异于所述野生型靶核酸的野生型反向核苷酸序列，且所述野生型反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；

第二靶特异性引物对能够扩增缺失型靶核酸，并且包含一个正向引物2和一个反向引物2，其中，所述正向引物2包含第二通用序列和特异于所述缺失型靶核酸的缺失型正向核苷酸序列，且所述缺失型正向核苷酸序列位于第二通用序列的3'端；所述反向引物2包含第一通用序列和特异于所述缺失型靶核酸的缺失型反向核苷酸序列，且所述缺失型反向核苷酸序列位于第一通用序列的3'端；

并且，在允许核酸杂交或退火的条件下，所述第一通用序列能够与所述第二通用序列的互补序列杂交或退火，且所述第二通用序列与所述第一通用序列存在差异，所述差异包括位于第一通用序列3'端的一个或多个核苷酸各自独立地被缺失或置换；并且，所述第一通用序列不能与所述正向引物1或正向引物2的互补序列完全互补；

(b)在允许核酸扩增的条件下，使用所述通用引物以及所述第一靶特异性引物对和第二靶特异性引物对，通过PCR反应扩增样品中的靶核酸；

(c)对步骤(b)的产物进行熔解曲线分析；并根据熔解曲线分析的结果，确定每一种缺失型靶核酸和/或野生型靶核酸是否存在于所述样品中，并确定每一种核苷酸片段缺失是否存在于所述样品中的靶核酸中。

2.权利要求1的方法，其中，所述方法具有选自下列的一个或多个技术特征：

(1)所述方法用于检测1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个靶核酸；

(2)在所述方法的步骤(a)中，提供1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-50个或更多个第一靶特异性引物对和/或第二靶特异性引物对；

(3)在所述方法的步骤(b)中，所述通用引物的工作浓度高于所述正向引物1、正向引物2、反向引物1和反向引物2的工作浓度；例如，所述通用引物的工作浓度比所述正向引物1、正向引物2、反向引物1和反向引物2的工作浓度高1-5倍，5-10倍，10-15倍，15-20倍，20-50倍或更多倍；

(4)在所述方法的步骤(b)中，所述正向引物1、正向引物2、反向引物1和反向引物2的工作浓度是相同的或者各自不同的；

(5)所述样品或靶核酸包含mRNA，且在进行所述方法的步骤(b)之前，对所述样品进行逆转录反应；

(6)在所述方法的步骤(b)中，使用核酸聚合酶(特别是模板依赖性核酸聚合酶)来进行PCR反应；优选地，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶，例如热稳定的DNA聚合酶；优选地，所述热稳定的DNA聚合酶获自，Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophiles(Tth),Thermusfiliformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis,Thermus antranildanii,Thermus caldophllus,Thermus chliarophilus,Thermus flavus,Thermus igniterrae,Thermus lacteus,Thermus oshimai,Thermus ruber,Thermus rubens,Thermusscotoductus,Thermus silvanus,Thermus thermophllus,Thermotoga maritima,Thermotoga neapolitana,Thermosipho africanus,Thermococcus litoralis,Thermococcus barossi,Thermococcus gorgonarius,Thermotoga maritima,Thermotoganeapolitana,Thermosiphoafricanus,Pyrococcus woesei,Pyrococcus horikoshii,Pyrococcus abyssi,Pyrodictium occultum,Aquifexpyrophilus和Aquifex aeolieus；优选地，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶；

(7)所述核苷酸片段缺失是指至少200个连续碱基的缺失；

优选地，所述核苷酸片段缺失是指至少500个连续碱基的缺失；

优选地，所述核苷酸片段缺失是苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因大片段缺失；优选地，所述PAH基因大片段缺失选自Ex1del5.3kb、Ex3del6.6kb、Ex4del、Ex5del、Ex6del、Ex1del3.7kb、Ex3del4.7kb、Ex5_6del、Ex4_7del、Ex4_5del，或其任何组合；

(8)在步骤(a)中，当与野生型靶核酸杂交时，所述反向引物1距离所述正向引物1不超过500bp，例如，为200-500bp；和/或，当与野生型靶核酸杂交时，所述反向引物2距离所述正向引物1和/或正向引物2至少500bp，例如，至少600bp，至少700bp，至少800bp，至少900bp，至少1000bp或更远。