[发明专利]一种神经干细胞冻存液及其应用

说明书

本发明公开了一种神经干细胞冻存液及其应用，涉及生物技术领域。本发明的冻存液包括无机盐，维生素，化学小分子抑制剂，细胞因子和DMSO等成份，冻存液成分明确，不含血清或动物源性成分。本发明的干细胞冻存液既不使用动物血清，也不含有动物源成分，该冻存液化学成分明确，能够大大提高细胞复苏后细胞活力。此外，本发明与商品化对照相比，价格低廉，使用方便，大大降低了细胞冻存过程中的死亡率。因此，本发明所述冻存液大大拓展了诱导神经细胞的临床应用前景。

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种神经干细胞冻存液及其应用。

【背景技术】

外胚层是胚胎发育过程中形成的最外层，随着器官发生的开始，外胚层细胞逐渐分化为大脑，脊髓，感觉器官等重要的系统。其中神经系统是负责思维，情感，感知，运动等功能的重要系统。相比于肿瘤等疾病，目前神经系统疾病的药物数量较少，且研发周期漫长，其中最为重要的一个原因为外胚层谱系中多种原代细胞的特殊性，例如原代神经元的不可再生性造成了神经系统药物体外药物筛选平台的稀缺。

除了可以用于药物筛选之外，外胚层细胞的体外再生能治疗多种退行性疾病，例如神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，该疾病的治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。神经退行性疾病和脊髓损伤的研究难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，体外疾病模型的稀缺是基础研究的限制性因素，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。而再生医学的发展为神经退行性领域的发展提供了新的思路。

再生医学是指利用多种新型技术学科来重建老化或功能损失的组织和器官，并通过多种医学手段来进行相关疾病治疗的新兴科学。再生医学的重要研究方向为正常组织特征与功能的机理，创伤后修复的生物学基础，以及组织器官的再生机制及多种干细胞分化机理，从而最终获得有效的生物治疗方法。其研究方法综合了多种手段，包括生命科学、材料科学，临床医学等学科的原理和方法，综合解决用于替代、修复、重建或再生人体各种组织器官的临床解决方案。

2006年，山中伸弥的团队发明了一种由OCT4,SOX2,KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化神经性的干细胞，这种干细胞被称为诱导神经干细胞(induced pluripotent cells)(Takahashi K,etal.，Cell，2006，126(4)pp.663-676；Takahashi K andYamanaka S，Cell，2007，131(5)pp.861-872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层，中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一发明突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制。以神经系统为例，目前在再生医学领域，神经干细胞及神经元的诱导多采取SMAD途径双重抑制法(Dual SMAD inhibition)(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol，2009，27(3):275-80)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGFBeta途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。其中LDN-193189和SB431542是广为使用的两种化学小分子抑制剂，分别通过作用于BMP4途径中的ALK2和ALK3，以及TGFBeta途径中的ALK5来达到移植内胚层及中胚层形成，从而起到诱导外胚层发育及神经发生的作用。通过这种方法，可以在血清类成分(Knockout Serum Replacement)的存在下得到诱导的神经细胞(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol.，2013，30(7):715–720)。这些诱导神经细胞的研究为神经退行性疾病的治疗提供了崭新的思路。