[发明专利]一种肝病重症化的分子标志物及其应用

说明书

一种肝病重症化生物标志物与应用。所述肝病重症化生物标志物包括EFEMP1、THBS2、LUM三种基因中的至少一种。所述生物标志物与肝纤维化进展具备显著相关性，可用于制备肝病纤维化辅助诊断或者预后制剂。所述生物标志物制剂包括定量PCR引物和试剂及其使用方法，可对肝病纤维化程度进行筛查和判断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。

技术领域

本发明涉及肝病诊断技术领域，涉及肝纤维化进展的生物标志物及其应用。具体地，本发明涉及EFEMP1、THBS2、LUM基因及所述基因在肝病纤维化辅助诊断或者预后中的应用。

背景技术

当前肝病谱的各类病因包括病毒性肝炎、酒精性肝病、代谢性肝病、药物性肝病、遗传性肝病等，而肝纤维化是众多肝脏疾病自然史中向疾病重症化进展的关键节点。若肝纤维化持续发展至中晚期后即出现肝硬化，形态学有纤维化弥漫、肝小叶结构破坏伴异常结节形成，临床导致门脉高压症和肝功能衰竭等表现。疾病进程中，早期肝纤维化通过及时干预可以阻滞或逆转，而晚期将呈不可逆病变，严重影响患者的生活质量与生命。

随着社会经济进步，非酒精性脂肪性肝病(简称脂肪肝，NAFLD)已成为当代肝病的主要构成之一。西方普通人群NAFLD流行率20-30％，亚洲人群达5-18％。尽管多数单纯性脂肪肝呈良性病变，25％的患者可进展为脂肪性肝炎(NASH)，并呈重症化发展至终末期肝病如肝硬化、肝衰竭及肝癌。

作为金标准的病理诊断，NAFLD病理学分级通常使用如NAFLD活性分值评分系统(NAS)，着重于气球样变、脂肪变及小叶炎症的评分；而GS量化评价常用于评估NAFLD等肝病的炎症与纤维化,但两者的评估并不往往一致。临床表型中，尽管多数NAFLD患者不发展为临床显著肝病，部分患者可快速进展为肝硬化、肝癌。对于NASH确诊患者，NASH的严重性通常与纤维化的分期相关，预计40-50％的NASH患者进展为肝硬化、肝癌。当严重的纤维化出现时，NASH不再具备预后意义。相对的，肝活检出现纤维化分期进展，特别是显著性(F≧2)纤维化是肝病相关死亡率的独立预测因子。因此，从纤维化角度早期预警具有重症化倾向的患者是NAFLD等诸多肝病管理的强烈指征。

目前肝纤维化的判别依赖于：1)组织病理学检查；2)肝纤维化的血清学诊断；3)影像学诊断。肝活检有其创伤性的明显局限，如：病变不均一有可能造成取样误差；难以在同一病人中反复多次进行，不便于观察肝纤维化的动态变化。血清学诊断中常采用肝纤维化四项如血清III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、IV型胶原(Ⅳ-Col)、层连蛋白(LN)、透明质酸(HA)。肝纤维化四项受肝脏炎症影响较大，并且在其他脏器疾病如部分恶性肿瘤、结缔组织病、甲状腺功能亢进、糖尿病等中也可出现异常，因此特异性不高。各种常用的影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像等，对晚期肝硬化的表征较为清楚，对于早期纤维化的进展较为模糊且受到机器限制。因此，迫切需要简便易行、准确度高的新型肝纤维化指征。

对于生物标志物的表达检测，实时定量PCR(qPCR)是目前核酸检测的主流。其中嵌合染料如Green 1或是较为经济的检测信号。SYBR等嵌合染料存在非序列依赖性结合的特征，不适合多重检测。目前已相继开发出序列特异杂交探针，如水解探针(TaqMan)、分子信标(Molecular Beacon)等。所有这些探针均需针对每一检测靶标进行设计与优化。目前很少有超过2重反应的序列特异杂交探针报道。

核酸酶的发现迄今已愈十余年，包括DNA酶或RNA酶。核酸酶的序列构造包含酶活性结构域与底物识别域。核酸酶在其底物存在时，能催化RNA或DNA底物的剪切、连接、磷酸化、去糖基化等反应。已知天然存在的核酶数目正不断增长，而通过体外定向分子进化的方法，具有产生特定功能特征的核酸酶分子的潜力。比如从含有随机序列的文库里分离得到具有催化功能的人工DNA酶。同时，DNA酶功能域分割的发现拓展了DNA酶的具体应用。例如Kolpashchikov所试验的E6 DNAzyme，含有非保守的茎环结构，只有与模板杂交时，才组装成核酸酶结构。Mokany等使用核酸酶结构用于MNAzyme定量PCR反应。这种思路可促进通用性报告探针的设计，进而组装简易高效的多重qPCR反应方案。