[发明专利]一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明的目的是为了解决如何提高Coleophoma sp.同源重组效率的问题。本发明提供的一种利用ku80基因缺失提高同源重组效率的Coleophoma sp.基因工程菌，以其为出发菌，将打靶元件中的外源基因以同源重组的方式定点整合到基因组上，同源重组效率达到90％以上，为基因打靶技术在丝状真菌中的应用提供了好的理论基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

环脂肽类化合物是一种重要的微生物天然产物，被报道具有多种生物活性，被开发成为抗真菌药物、免疫抑制剂等多种药物。鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)被报道能够合成环脂肽类化合物，但是由于同源重组效率低，使得基因打靶等遗传改造难度大，限制了环脂肽类化合物合成机制解析和代谢工程改造。开发一种遗传改造高效的Coleophomasp.底盘细胞及其方法具有重要应用价值。

基因打靶技术是现代分子生物学的一个重要研究手段，通常是指利用同源重组的方法将含已知序列的外源DNA片段与生物体基因组发生结合，整合至受体染色体特异性靶位点上。该技术可增加外源DNA片段，或者删除同源臂之间DNA片段，可以用于基因敲除、基因替换和外源基因定点过表达等多种遗传改造。因此，基因打靶技术在代谢工程改造研究中发挥着非常重要的作用。在丝状真菌中DNA双链断裂修复主要依靠非同源末端连接途径(Non-homologous End Joining，NHEJ)，导致外源DNA主要以随机插入方式整合至基因组染色体上，同源重组效率低下，严重制约了基因打靶技术在丝状真菌中的应用。因此一种高效的基因打靶技术将可以为Coleophoma sp.中环脂肽类化合物生物合成途径研究以及菌株基因工程改造提供重要技术支持。

发明内容

本发明的目的是为了解决如何提鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)基因打靶效率的问题，为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种同源重组高效的鞘茎点霉属(Coleophoma sp.)的基因工程菌，所述基因工程菌是通过失活出发菌中非同源末端连接途径所得到的基因工程菌。

进一步地限定，所述基因工程菌是以鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)为出发菌，通过失活出发菌中ku80基因所得到的基因工程菌Coleophoma sp.-△ku80。

进一步地限定，所述ku80基因序列如SEQ ID NO.15所示。

本发明还提供了上述的同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌的构建方法，所述构建方法是敲除鞘茎点霉属真菌(Coleophoma sp.)非同源末端连接途径中的关键基因。

进一步地限定，所述关键基因是ku80基因，所述构建方法的具体步骤如下：

(1)构建ku80打靶元件：以Coleophoma sp.的基因组为模板，用PCR扩增获得ku80的上游序列Uku80和下游序列Dku80，然后以pXH2-1为模板，通过PCR扩增出hph片段；通过融合PCR将上游序列Uku80、下游序列Dku80和hph片段进行融合，再以融合产物作为模板，扩增出打靶元件Uku80-hph-Dku80；

(2)将步骤(1)得到的ku80打靶元件转化到Coleophoma sp.的原生质体中，用潮霉素抗性筛选及基因组验证后获得敲除ku80基因的基因工程菌Coleophoma sp.-△ku80。