[发明专利]一种创建高棕榈酸和多叶片转基因植株的方法及应用

权利要求书

1.一种脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，其特征在于，所述AhFATB2基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因创建转基因植株的方法，其特征在于，以野生型植物为转基因受体，通过基因工程手段，应用脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因，通过过表达AhFATB2基因，人工创建转基因植物；所述AhFATB2基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)花生脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因的克隆；

(2)AhFATB2基因的植物过表达载体pBI-AhFATB2的构建；

(3)pBI-AhFATB2在拟南芥中的遗传转化和阳性苗筛选，获得转基因植株。

4.如权利要求3所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述AhFATB2基因的克隆方法为：利用Trizol进行花生种子RNA的提取，以RNA逆转录的cDNA为模板进行AhFATB2基因的扩增，引物为AhFATB2S和AhFATB2A；

AhFATB2S:5′-CGCGGATCCATGGTTGCTACTGCTGCTACG-3′；

AhFATB2A:5′-GACGAGCTCTCAGTTTTCTGCTGGAAAAACC-3′。

5.如权利要求4所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述AhFATB2基因扩增的反应体系为25μL内含：1×PCR buffer，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物浓度均为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板100ng；

PCR程序为：94℃，5min；94℃，45s，57℃，45s，72℃，2min，33个循环；72℃，10min。

6.如权利要求3所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述过表达载体pBI-AhFATB2的构建方法为：用步骤(1)克隆得到的AhFATB2基因片段替换质粒pBI121上的GUS基因片段。

7.如权利要求6所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述过表达载体pBI-AhFATB2构建的具体方法为：用BamHI和SacI双酶切克隆载体pBI121的GUS片段，同时用BamHI和SacI酶切步骤(1)克隆得到的AhFATB2基因片段；将AhFATB2基因片段的酶切产物和克隆载体pBI121上切下的片段混合，用DNA凝胶回收试剂盒回收，混合后加入T4 DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，用无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜，转化后，即得重组质粒pBI-AhFATB2。

8.如权利要求3所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体方法为：制备含有重组质粒pBI-AhFATB2的根癌农杆菌GV3101菌液，转化植株，筛选得到重组质粒pBI-AhFATB2成功转入植株的转基因阳性苗，将阳性苗自交3代以上，获得纯合植株HF-AhFATB2。

9.如权利要求8所述的创建转基因植株的方法，其特征在于，所述阳性苗的筛选方法为：当叶片长到3-4叶期时，取绿苗叶片进行PCR阳性检测，引物为：

AhFATB2S:5′-CGCGGATCCATGGTTGCTACTGCTGCTACG-3′；

AhFATB2A:5′-GACGAGCTCTCAGTTTTCTGCTGGAAAAACC-3′；

PCR反应体系为：基因组DNA模板1μL、10×Taq酶反应缓冲液2uL、25mM MgCL₂ 1.2uL、2mMdNTP 1.5uL、10uM引物各0.2uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μL；

反应程序为：94℃变性5min；94℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；32循环，72℃延伸5min。

10.一种如权利要求1所述的脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶AhFATB2基因在提高油料作物种子棕榈酸含量和提高植物叶片生物量中的应用。