[发明专利]一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用。将BVDV‑LC株E2基因连接至pFastBac1重组杆状病毒转移载体，在大肠杆菌中通过同源重组获得重组杆状病毒载体rBacmid‑E2，转染Sf9昆虫细胞后获得第一代重组杆状病毒P1，将P1代病毒继续感染Sf9昆虫细胞获得感染能力高的第二代重组杆状病毒P2，再将P2代病毒扩大培养后纯化得到E2蛋白。将本发明制备的E2蛋白作为诊断抗原和亚单位疫苗，能够表现出更好的优势，可以作为候选抗原进行疫苗和ELISA试剂盒的开发。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用。

背景技术

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的一种复杂的，多临床类型的疾病。该病主要以发热、腹泻、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、免疫耐受与持续感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、怀孕母牛流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传染病。我国畜牧业迅速发展的同时，养殖规模和养殖数量在急剧增加，跨地区的贸易也越来越频繁，导致牛、羊发病率不断提高。其中牛病毒性腹泻黏膜病对牛健康和生产危害较大，给养牛业造成了严重的经济损失。目前，防治该病最有效的方法是筛除病牛并对其余牛进行疫苗接种，但常见的商品化疫苗多为灭活苗，需要多次免疫(一免后一个月需要二次免疫)，保护期短(二免后只能保护4个月)、价格昂贵、不能区分自然感染和疫苗免疫。而且，该疾病商品化的诊断试剂盒来自于美国IDEXX公司，价格昂贵，因而不能满足防治BVDV的要求。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统由于具有适当的翻译后修饰，而且具有生物安全性等优点，已被广泛用于疫苗和诊断的开发和生产中。目前已有多种杆状病毒-昆虫细胞系统生产的疫苗被投入使用，如人乳头瘤病毒疫苗、人细小病毒HPVB19、猪圆环病毒疫苗、猪瘟病毒E2蛋白疫苗等等。BVDV具有4个结构蛋白，其中E^rns和E2是主要的保护性抗原，能够诱导病毒中和抗体并保护牛免受BVDV攻击，而E^rns蛋白具有独特的RNase活性，可降解单链和双链RNA，对于限制宿主对双链RNA的先天免疫反应至关重要，帮助BVDV逃避先天免疫在其宿主中建立持续感染。

本发明选用E2蛋白，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统在昆虫细胞内组装成具有良好反应原性的蛋白，进一步地研究该蛋白在疫苗和诊断方面的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法，包括以下步骤：

将BVDV-LC E2基因序列前端添加His标签后，连接至pFastBac1质粒，得到重组转移载体；

将重组转移载体转化至E.coli DH10Bac^TM中，得到重组杆粒；

用重组杆粒转染Sf9昆虫细胞收获P1代重组杆状病毒；

将P1代病毒继续感染Sf9昆虫细胞获得感染能力高的第二代重组杆状病毒P2；

再将P2代病毒扩大培养后纯化得到E2蛋白。

进一步地，所述BVDV-LC E2基因序列见SEQ ID NO.1所示。

进一步地，通过同源重组的方法将重组转移载体转化至E.coli DH10Bac^TM中。

进一步地，Sf9昆虫细胞的培养条件为27℃。

本发明还披露了利用上述的方法制备的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白。