[发明专利]胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法

权利要求书

1.用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。

2.根据权利要求1的培养基，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。

3.根据权利要求2的培养基，所述DMEM-F12培养基的配制方法为：将各物料用1000ml溶解，0.22µm微孔滤膜过滤除菌，即得。

4.分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中：

(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；

(a2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm²大小，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1% Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(a5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80%以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞，即P0代；

(b)传代培养胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(b1)按照5000/cm²密度接种原代即P0代间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO₂培养箱中，于5% CO₂，37℃，饱和湿度条件，中培养至细胞融合度达70~80%时，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞；

(b2)按照5000/cm²密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO₂培养箱中，于5% CO₂，37℃，饱和湿度条件，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞，

其中，

所述D-Hanks液的配方组成为：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.08g的Na₂HPO₄.12H₂O、0.35g的NaHCO₃、水至1000ml；

所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：1%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12%硫代甘油、1%果糖；

所述传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。