[发明专利]细胞内溶解氧测量用单分散荧光纳米传感器及其制备方法

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，具体为一种细胞内溶解氧测量用单分散荧光纳米传感器及其制备方法。本发明的单分散荧光纳米传感器，是包裹有氧气敏感探针的聚苯乙稀纳米颗粒，颗粒粒径为50 nm‑200 nm。本发明以对氧气敏感的疏水性有机金属配合物作为氧敏感探针，苯乙烯作为聚合物单体，Lutensol AT‑50作为表面活性剂，V‑50作为聚合引发剂，采用细乳液聚合法得到尺寸均匀、单分散的氧敏感荧光纳米颗粒；本发明制备方法，成本低、工艺简单，制备的纳米传感器用于检测细胞内溶解氧灵敏度高，且不受环境因素干扰，检测准确性高；还具有优异的生物相容性，细胞毒性极低。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种细胞内溶解氧测量用单分散荧光纳米传感器及其制备方法。

背景技术

细胞是组成生命的最基本单元，细胞生命活动所需的绝大多数能量都来源于细胞的有氧呼吸作用。细胞的有氧呼吸作用主要发生在线粒体，其中氧气作为关键的氧化剂，与细胞内的还原性质子发生反应，产生水的同时释放大量能量，释放的能量驱动了三磷酸腺苷（ATP）的合成。因此，适当的氧浓度对于维持细胞的正常生命活动至关重要。氧浓度过低会引起线粒体功能障碍，而氧浓度过高可能会促进细胞内活性氧物种的产生，损伤细胞内遗传物质、细胞膜等。因此，准确检测细胞内溶解氧浓度对于监控细胞的正常状态具有重要意义。

传统的氧传感器大多基于滴定法、电化学法、压力法等检测手段，由于其较大的体积、复杂的检测手段、以及对样品的损坏性限制了其在生命科学领域的应用。近年来，随着荧光成像技术的发展，基于荧光染料的氧敏感荧光传感器引起了人们的广泛关注(Wang Wolfbeis, 2014)。其具有测量速度快、灵敏度和准确度高、对样品无损害以及可实现远程测量的特点，可用于细胞内溶解氧的快速检测和成像。彭洪尚课题组报告了一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器（CN103575717B），其利用沉淀法制备了以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅为核，以多聚赖氨酸为壳的核壳结构的纳米颗粒，氧气探针分散在核层，壳层表面偶联三苯基膦基团。但是通过沉淀法制备的纳米颗粒通常具有较宽的尺寸分布（其所制备的纳米颗粒尺寸在100~150 nm），且纳米颗粒的表面化学惰性特征使得其后续的表面修饰比较困难。根据文献报道(Zhu et al., 2013)，具有更小尺寸的纳米材料更易进入细胞，且纳米颗粒进入细胞以及进入细胞后的生物学行为均与其尺寸、形貌及表面化学性质等密切相关，因此有必要开发一种尺寸和形貌可控、粒径均匀且表面易进行化学修饰的单分散荧光纳米氧传感器。

本发明报道了一种利用细乳液聚合法合成包埋有氧气敏感探针的聚苯乙烯纳米颗粒，其具有以下特征：（1）可通过调节反应物的比例(如表面活性剂、苯乙烯等原料用量)来有效调控合成的纳米颗粒的尺寸，合成一系列尺寸均匀、单分散的荧光纳米传感器，且颗粒的粒径可以在50~200 nm范围内进行精确地调控。（2）尺寸均匀，在水溶液中呈单分散性，可长期储存于乙醇或水溶液中。（3）可通过在合成过程中加入共聚物进行纳米颗粒表面的功能化修饰。（4）具有良好的生物相容性，可实现细胞内溶解氧浓度的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、制备简单、灵敏度好、可逆性好的用于细胞内溶解氧检测的单分散荧光纳米传感器及其制备方法。

本发明提供的细胞内溶解氧检测用单分散荧光纳米传感器，是一种包裹有氧气敏感探针的聚苯乙稀纳米颗粒，颗粒粒径为50 nm-200 nm；所述氧气敏感探针为对氧气敏感的疏水性有机金属配合物。

本发明中，所述疏水性有机金属配合物，其种类包括但不仅限于铂和钯卟啉配合物、钌配合物、铱配合物。

本发明提供的细胞内溶解氧检测用单分散荧光纳米传感器的制备方法，采用细乳液聚合法，以对氧气敏感的疏水性有机金属配合物作为氧敏感探针，苯乙烯作为聚合物单体，Lutensol AT-50作为表面活性剂，V-50作为聚合引发剂，采用细乳液聚合法（一锅法）得到尺寸均匀、单分散的氧敏感荧光纳米颗粒。具体步骤如下：