[发明专利]一种小型阻断肽的设计筛选方法及其用于合成纤维化疾病治疗药物的应用

说明书

本发明属于阻断肽合成技术领域，具体涉及小型阻断肽的设计筛选方法及其用于合成纤维化疾病治疗药物的应用。其有益效果在于：提供了一种新的纤维化疾病治疗药物的原料。相对于抗体作为传统纤维化疾病治疗药物的原料，本发明技术方案生产成本和方法，免疫激活风险、脱靶效应的风险等方面均有优异表现。

技术领域

本发明属于阻断肽合成技术领域，涉及小型阻断肽的设计筛选方法及其用于合成纤维化疾病治疗药物的应用。

背景技术

纤维化是一种疾病过程，其特征在于过度和无组织的细胞外基质(ECM)沉积，导致毁容、器官功能障碍，并且在一些情况下，导致器官衰竭和死亡。

促成纤维形成和纤维化发作的主要细胞类型是α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)应力纤维阳性和收缩性肌成纤维细胞。肌成纤维细胞介导的进行性纤维化可降至大多数器官和组织，引起包括硬皮病、心肌梗塞、肝硬化、肺病和慢性肾脏疾病等在内的多种终末期器官疾病。

纤维化ECM由大量活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞合成的胶原蛋白I组成。纤连蛋白(FN)的可变剪接变体含有纤连蛋白的额外结构域A(EDA-FN)、糖胺聚糖、透明质酸。经典观点认为，对于活化的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，转化生长因子-β1(TGF-β1)和含EDA-FN的机械硬化ECM的存在是必需的前提和要求。

研究发现EDA-FN剪接变体仅在伤口修复中表达。EDA-FN在正常成人中很难检测到组织，仅在胚胎发生过程中瞬时表达。虽然未受伤的成年EDA-FN缺失小鼠与野生型小鼠无法区分，但受伤的对应小鼠在受伤部位表现出异常的皮肤伤口愈合、溃疡和炎症升高。

在一系列人类纤维化疾病中观察到EDA-FN同种型的持续积累。小鼠基因敲除EDA-FN-null模型在博来霉素损伤后不发展肺纤维化，并显示活化成纤维细胞数量减少至肌成纤维细胞分化。这些发现证明了EDA-FN在纤维化的发病机理中发挥不可或缺的作用，并且其表达使活化的成纤维细胞进行肌成纤维细胞分化。

EDA-FN促进纤维化反应的详细细胞机制尚未完全阐明，但有证据表明潜在TGF-β1活化之间的相互作用，EDA-FN依赖性增加基质应力-应变特性和某些机械转导整合素受体的激活，以触发下游信号和转录活性，累积到驱动肌成纤维细胞分化过程。在纤维发生的背景下，Shinde等人的研究和Kohan等人EDA-FN/整合素相互作用表明，成纤维细胞表达的整合素α4β1和α4β7分别在介导成纤维细胞向肌成纤维细胞形成中发挥不同但相关的作用。

整合素α4β7介导的EDA-FN诱导肌成纤维细胞相关的应力纤维形成，从而诱导小鼠肺成纤维细胞的收缩。而整合素α4β1被EDA-FN激活促进了原纤维化ECM合成和随后的人真皮成纤维细胞基质硬化。两者都是最终导致成熟肌成纤维细胞转分化的关键事件。该研究确定整联蛋白与EDGIHEL基序的相互作用，其仅位于EDA C'-C区域的多肽暴露环内，是下游促纤维化反应的原因。

抗体IST-9和F8可以靶向EDA-FN并从其相互作用位点掩蔽大部分蛋白质，基本上阻断功能性。事实上，基质肌成纤维细胞产生的针对EDA-FN的治疗性疫苗接种可以减轻转移性乳腺癌的进展。虽然已经证明抗体可有效预防成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，但鉴于它们的生产成本和方法，免疫激活风险以及大量的脱靶效应的风险，它们作为治疗选择的用途是有限的。

四级结构和大小(～150kDa)的抗体干扰关键的蛋白质-蛋白质相互作用。小的封闭肽提供了一种有吸引力的替代方案，可以设计用于以高特异性结合和阻断蛋白质区域。小肽也可以以降低的成本合成，具有长期稳定性并且可以增加多种治疗选择的功效。例如，小肽可以容易地掺入生物材料中，或与生物成像探针缀合以用于更复杂的治疗用途。