[发明专利]两种植物基因编辑工具

说明书

本发明属于生物工程技术领域，提供了两种植物基因编辑工具，其为能够在植物细胞中识别新的PAM序列的核酸酶基因,其序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。该基因或相应载体可用于植物基因编辑以及作物性状改良。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够在特定序列实现核酸剪切的核酸酶基因其构建方法。

背景技术

通过CRISPR-Cas9技术在生物体内进行基因编辑是生命科学领域内的重大突破。在引导RNA(gRNA)的引导下，gRNA-Cas9复合物专一结合与gRNA互补的 DNA区域，并切断DNA双链，细胞随即展开修复。如果修复过程中没有可供修复的DNA模板，修复的过程会引入大量的随机突变；如果提供修复模板，就有可能将修复模板整合在DNA中，从而引入设计的突变类型。

Cas核酸酶在DNA特定区域切割需要同时满足两个条件，一是与引导RNA互补的序列，二是在互补序列旁边要有合适PAM序列。例如Cas9需要有NGG的PAM 序列。PAM序列限制了相关核酸酶对DNA剪切的广适性，因此识别其它PAM的Cas 酶变体被不断地被开发出来。例如识别NG PAM的xCas9和NG-Cas9,识别NGA PAM 的VQR-Cas9等。能够具有识别新PAM序列的Cas变体将极大扩展其基因编辑的能力。

发明内容

本发明对识别NNG及NAA PAM的两个Cas9变体根据玉米偏好密码子进行了优化，分别得到了SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的基因序列以及对应的SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4的氨基酸序列。

在基础载体上，例如pHUE411的骨架上，将其中所含的Cas9基因分别替换成序列1和序列2所述基因，形成pHUE411-Scpp和pHUE411-ispyMac两个载体。根据相应的PAM序列，在植物基因组上选择合适的靶点序列，并克隆到上述载体中。提取质粒备用。准备水稻原生质体，利用上述质粒，对其进行转染，提取 DNA，分析水稻基因组中的靶点是否发生变化。将上述载体转入农杆菌或通过基因枪转化水稻愈伤组织，即可得到成功编辑的植株。

此外，还可以将上述核酸酶基因中起酶切关键作用的氨基酸(例如Cas9氨基酸序列中的D10或H840)进行突变，形成识别相应PAM的nickase变体。在此基础上，可以与不同的脱氨酶(例如胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶)融合，形成识别不同PAM的单碱基编辑器。

一方面，本发明提供了一种基因编辑载体，其特征在于，所述载体在基础载体的基础上构建，5’到3’包括植物细胞高表达启动子、Cas变体基因和终止子。

进一步地，所述植物为拟南芥、水稻、棉花、玉米、小麦、大豆、油菜、向日葵、白菜、西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄或中草药。

进一步地，所述Cas变体基因进行了植物偏好密码子的优化，识别NNGPM，序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述Cas变体基因进行了植物偏好密码子的优化，识别NAAPAM，序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述Cas变体基因所编码的氨基酸序列中D10或H840被突变形成nickase变体。

进一步地，所述Cas变体基因与脱氨酶融合形成单碱基编辑器。

进一步地，所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶

另一方面，本申请提供了玉米偏好密码子优化的Cas变体基因，其序列为 SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2。

另一方面，本申请提供了上述载体或Cas变体基因在植物基因编辑中的应用。

另一方面，本申请提供了上述载体或Cas变体基因在改良作物性状中的应用。